近年來越來越多的證據(jù)表明，活性氧簇具有生長(zhǎng)抑制效果，例如過氧化氫能夠?qū)е卵趸瘧?yīng)激和細(xì)胞損傷，由于在人工生長(zhǎng)培養(yǎng)基中產(chǎn)生了過氧化氫，導(dǎo)致微生物的生長(zhǎng)效率明顯降低。雖然分子生態(tài)學(xué)和宏基因組學(xué)已經(jīng)明顯增加了我們對(duì)于微生物多樣性的了解，并且引導(dǎo)產(chǎn)生了許多有趣的假設(shè)，但是這些先進(jìn)的技術(shù)也顯示出我們距離充分闡明微生物多樣性還很遠(yuǎn)。同時(shí)，考慮到許多基因儲(chǔ)存在具有未知功能或錯(cuò)誤注釋的數(shù)據(jù)庫(kù)中，僅使用宏基因組學(xué)的方法不能提供足夠的信息去培養(yǎng)所有的微生物。實(shí)際上，只有通過細(xì)菌純培養(yǎng)的研究才能充分地闡述其表型和基因型。考慮到微生物培養(yǎng)在現(xiàn)代微生物學(xué)中的重要性，分離培養(yǎng)未培養(yǎng)微生物仍然是優(yōu)先考慮的思路。因此，一個(gè)重要的挑戰(zhàn)就是如何克服目前存在的限制因素，擴(kuò)大可培養(yǎng)的范圍。本文將綜述目前未培養(yǎng)微生物分離培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展(表1)，為分離未培養(yǎng)微生物和研究其生態(tài)學(xué)功能提供參考。

1未培養(yǎng)微生物的限制因素

1.1 培養(yǎng)基組分和生長(zhǎng)條件不全面

任何微生物的生長(zhǎng)都需要能量、營(yíng)養(yǎng)和適當(dāng)?shù)奈锢砘瘜W(xué)成分，并且不同的微生物所需的濃度是不同的。某些微生物在生長(zhǎng)的過程中，需要特殊的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、pH條件、培養(yǎng)溫度和合適的氧氣濃度。K?pke等研究不同的培養(yǎng)基基質(zhì)和培養(yǎng)條件對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響后發(fā)現(xiàn)，不同的條件下微生物生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯差異。

1.2 忽視了環(huán)境中微生物之間的相互作用

自然環(huán)境中的大部分微生物都是群體生活，并且相互之間建立了復(fù)雜的關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，單純地將待培養(yǎng)的微生物與其他相關(guān)的微生物群體分開，物種之間的信息交流被阻斷，微生物因缺乏必需的生長(zhǎng)因子和信號(hào)分子而無(wú)法生長(zhǎng)，表現(xiàn)為不可培養(yǎng)。在原核生物中，種間互作普遍存在并且不會(huì)受到信號(hào)分子的限制，例如自體誘導(dǎo)分子2(AI-2)和N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯。

培養(yǎng)時(shí)間短

在某些情況下，培養(yǎng)效率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加。許多微生物，特別是生活在營(yíng)養(yǎng)不充足環(huán)境中的微生物生長(zhǎng)速率是很慢的。因此，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間是提高這類微生物培養(yǎng)效率的先決條件。Davis等培養(yǎng)土壤微生物至少12周的時(shí)間，結(jié)果顯示菌落計(jì)數(shù)明顯增加并且分離出幾株之前未培養(yǎng)的菌株。

檢測(cè)靈敏性受限

對(duì)于某些微生物生長(zhǎng)速率慢、產(chǎn)量低的情況，如果檢測(cè)技術(shù)靈敏性不高，很可能得出錯(cuò)誤的結(jié)論，因此開發(fā)多種高靈敏性檢測(cè)方法對(duì)于認(rèn)識(shí)未培養(yǎng)微生物具有很大的作用。對(duì)于要通過菌落數(shù)量來研究其生理生態(tài)特性的微生物，高靈敏性的檢測(cè)方法如切向流過濾是極其重要的。

2未培養(yǎng)微生物培養(yǎng)分離技術(shù)

2.1調(diào)整培養(yǎng)基

在生長(zhǎng)的過程中，許多微生物有特殊的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和化學(xué)物質(zhì)的需求。這就需要對(duì)微生物生存的自然環(huán)境和特性有深刻的理解，包括與培養(yǎng)基生長(zhǎng)直接相關(guān)的各種因素，才能有助于研究者更好地理解這些因素并進(jìn)一步開發(fā)培養(yǎng)未培養(yǎng)微生物的方法。最近的一些研究探究了不同成分和濃度的培養(yǎng)基對(duì)于培養(yǎng)未培養(yǎng)微生物的影響。Li等應(yīng)用體外培養(yǎng)方法，在厭氧培養(yǎng)基中添加十八碳烯酸(TVA)至不同終濃度(0、30、40、50、60μg/mL)，接種瘤胃微生物后進(jìn)行連續(xù)和傳代培養(yǎng)，傳代富集培養(yǎng)時(shí)，用DGGE監(jiān)測(cè)菌群變化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)傳至第4代，TVA氫化菌群的數(shù)量增加最顯著，對(duì)差異條帶的測(cè)序結(jié)果表明這些細(xì)菌大多屬于未培養(yǎng)的瘤胃細(xì)菌。Davis等和Sait等參考系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)菌種，通過修飾和富集培養(yǎng)基成功地分離出之前未培養(yǎng)的微生物。微生物學(xué)家通過在培養(yǎng)基中加入氫氧化鐵和錳氧化物作為電子受體，實(shí)現(xiàn)了微生物的高效培養(yǎng)，例如變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、酸桿菌門、疣微菌門和鹽單胞菌門。Kashefi等根據(jù)嗜高熱微生物利用Fe(III)作為終端電子受體這一高度保守的特性，在培養(yǎng)基中添加非常微量的Fe(III)氧化物。該方法的前提是對(duì)微生物特性有一定的了解。Santini等從Aodaliya金礦中分出以亞砷酸為電子供體，氧為受體，以CO2為唯一碳源的優(yōu)能自養(yǎng)菌(NT-26)，16SrRNA基因序列分析表明，NT-26屬于α-Proteobacteria土壤桿菌的一個(gè)根瘤菌分支，可能是一新種。一些研究關(guān)注甲烷厭氧氧化對(duì)于硫酸鹽或硝酸鹽的還原作用。這些方法需要精確的培養(yǎng)基，其中包括碳?xì)浠衔锬芰縼碓春拖跛猁}，鐵和硫酸鹽作為電子受體。

對(duì)來自北海的樣本進(jìn)行的研究顯示，碳源的品質(zhì)是決定培養(yǎng)效率的關(guān)鍵因素。包含不同碳源和復(fù)雜化合物的培養(yǎng)基所培養(yǎng)出的微生物數(shù)量和多樣性比只含有一種碳源的培養(yǎng)基更高。相反地，許多自養(yǎng)微生物不能在只有一種固定碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。目前，通過使用低底物濃度的培養(yǎng)策略，針對(duì)未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)已經(jīng)取得一些成效。放線菌門、酸桿菌門、變形菌門和疣微菌門利用低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和增加培養(yǎng)代數(shù)進(jìn)而被成功地培養(yǎng)。改善培養(yǎng)條件(如營(yíng)養(yǎng)水平，氧氣濃度，腐殖酸的添加和信號(hào)分子)也增加了一些新型微生物。最近，科學(xué)家創(chuàng)新地開發(fā)出高選擇性培養(yǎng)基，最大的優(yōu)勢(shì)是該培養(yǎng)基對(duì)特定的微生物具有高選擇性。這種方法被用來開發(fā)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)水稻細(xì)菌性谷枯病菌、燕麥?zhǔn)乘峋?、果膠桿菌、青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌(表2)。在培養(yǎng)基中添加腐殖酸、信號(hào)分子、處理活性氧的酶類或移除某些抑制因子提高未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)性。一些微生物學(xué)家證實(shí)吉蘭糖膠對(duì)于未培養(yǎng)的微生物的培養(yǎng)和分離是有效的，因?yàn)樗钠桨宄煞直拳傊宄?，因此更容易找到非常?xì)微的菌落。吉蘭糖膠也可能增強(qiáng)受瓊脂抑制的微生物的生長(zhǎng)。吉蘭糖膠培養(yǎng)基上的菌落計(jì)數(shù)是瓊脂培養(yǎng)基的10倍。生長(zhǎng)在吉蘭糖膠培養(yǎng)基上大約60%的微生物被認(rèn)為是新的，在同樣的條件下，新分離得到的微生物中的一半在瓊脂培養(yǎng)基上不能形成菌落。

2.2群體培養(yǎng)

2.2.1共培養(yǎng)

在自然環(huán)境的微生物區(qū)系中，微生物間的相互作用對(duì)于群體生存是至關(guān)重要的，但是由于內(nèi)在的復(fù)雜性和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的困難性，這些相互作用間的確切機(jī)制仍然是不清楚的。傳統(tǒng)的以培養(yǎng)為導(dǎo)向的研究并不能解釋由信號(hào)分子介導(dǎo)的相互作用，這些信號(hào)分子嚴(yán)重地限制了對(duì)于未培養(yǎng)互養(yǎng)微生物的研究。因?yàn)槲⑸锟偸菚?huì)在一個(gè)群體中與其他微生物建立一種關(guān)系，并且這些相互作用一方能夠競(jìng)爭(zhēng)有限的資源，另一方面也會(huì)通過代謝物和信號(hào)分子的交流進(jìn)行合作。微生物之間相互交流的典型的例子比如生物膜和多細(xì)胞培養(yǎng)裝置，都可以實(shí)施單個(gè)物種培養(yǎng)不可能實(shí)現(xiàn)的多功能培養(yǎng)。例如，混合細(xì)胞組合能夠完成多級(jí)纖維素降解，并且產(chǎn)物中間體能被作為碳源進(jìn)行利用。Park等開發(fā)了一種簡(jiǎn)易的微液滴裝置用于高效培養(yǎng)互養(yǎng)微生物群體，同時(shí)來證明其在微生物間協(xié)同共生中的效果。微液滴裝置是單分散液滴中封裝和培養(yǎng)微生物群體中的小單元。如果液滴將有互作關(guān)系的微生物局部化，那么這些微生物將能夠分裂生長(zhǎng)(圖1A)。傾斜的T形連接用于液滴的產(chǎn)生，反應(yīng)室用于保留液滴進(jìn)而進(jìn)行培養(yǎng)(圖1B，C)，這個(gè)傾斜的T形連接能夠產(chǎn)生均勻分散的液滴，在入口的壓力下，至少1400個(gè)液滴能夠被非常緊密地包裹在10mm×5mm的反應(yīng)室內(nèi)(圖1D)。

共培養(yǎng)也是一種培養(yǎng)兼性或互養(yǎng)微生物的有效方法。到目前為止，兩種成功的例子已經(jīng)被報(bào)道：(1)一種利用透析膜反應(yīng)器的群體培養(yǎng)方法已經(jīng)成功地從厭氧淤泥中培養(yǎng)出厭氧嗜熱的降解谷氨酸的微生物。(2)另一種利用在厭氧和需氧交替的間歇反應(yīng)器中的群體培養(yǎng)成功富集到混合微生物。新的微生物通過與耗氫型微生物共培養(yǎng)或使用適合生長(zhǎng)的純培養(yǎng)基質(zhì)得以成功地鑒定。另外，在很多情況下，不同技術(shù)結(jié)合使用已經(jīng)取得了成功。例如，通過將適合生長(zhǎng)的環(huán)境條件與輔助菌株結(jié)合使用，Nichols等培養(yǎng)出一種新的嗜冷桿菌屬。輔助菌株提供了必要的生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子對(duì)于使用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)未培養(yǎng)菌株是重要的發(fā)現(xiàn)。其他的研究者已經(jīng)使用非共生的變形蟲作為一種工具來分離環(huán)境樣品中(包括土壤)新的胞內(nèi)微生物[40]。

圖1用于共培養(yǎng)的微流體裝置

注：A：利用共培養(yǎng)空間檢測(cè)微生物間的共生關(guān)系；B：微流體裝置原理圖；C：微流體裝置實(shí)物圖；D：微流體裝置內(nèi)液滴形成反應(yīng)室.

2.2.2原位培養(yǎng)

模擬目標(biāo)微生物的自然環(huán)境進(jìn)行原位培養(yǎng)和分離是目前研究者的一個(gè)基本策略。Kaeberlein等模擬海洋微生物自然生長(zhǎng)的環(huán)境，設(shè)計(jì)出名為擴(kuò)散生長(zhǎng)盒(Diffusiongrowthchamber)的自制培養(yǎng)儀器(圖2)，使用這種儀器來分離培養(yǎng)微生物。該擴(kuò)散盒由一個(gè)環(huán)狀的不銹鋼墊圈和兩側(cè)膠連孔徑為0.03μm的濾膜組成，濾膜既允許有益的小分子代謝物質(zhì)和圈內(nèi)外微生物產(chǎn)生的活性物質(zhì)透過膜自由進(jìn)出小室，化學(xué)物質(zhì)在盒內(nèi)和環(huán)境之間進(jìn)行交流又不能讓微生物細(xì)胞通過造成逃逸，因此使高密度培養(yǎng)成為可能。擴(kuò)散盒內(nèi)加入被分離的環(huán)境樣品即海洋微生物樣品與瓊脂的混合物，封閉后置于模擬采樣點(diǎn)環(huán)境條件的玻璃缸中進(jìn)行培養(yǎng)，并不斷注入新鮮的海水循環(huán)流動(dòng)。1周后，培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量形態(tài)各異的微型菌落，數(shù)目高達(dá)接種微生物的40%，微菌落中多數(shù)為混合培養(yǎng)，需再次分離以獲得純種。最后從海水中分離到一株新的菌株。不同類型膜基系統(tǒng)已經(jīng)被開發(fā)出來在自然環(huán)境中直接生長(zhǎng)微生物群體。來自土壤、海洋或活性污泥中的未培養(yǎng)微生物被培養(yǎng)在擴(kuò)散生長(zhǎng)盒中。據(jù)此得出了這種假設(shè)：在擴(kuò)散生長(zhǎng)盒里環(huán)境中原位培養(yǎng)的原核生物一方面進(jìn)行充分的菌株富集為了隨后的分離并移入傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基，另一方面在試管培養(yǎng)條件中使菌株適應(yīng)抑制性的條件。有趣的是，很多緩慢生長(zhǎng)的菌落應(yīng)用該方法也可以被成功培養(yǎng)。研究者已經(jīng)在模擬的自然環(huán)境中通過使用擴(kuò)散生長(zhǎng)盒測(cè)試了未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)性并取得了成功的結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，科研人員開發(fā)了一種新的高通量平臺(tái)用于大量培養(yǎng)和分離環(huán)境中的未培養(yǎng)微生物，這種平臺(tái)被稱為分離芯片(Isolationchip，Ichip)。Ichip由數(shù)百個(gè)微型擴(kuò)散室組成，每個(gè)室可接種單個(gè)的環(huán)境細(xì)菌。通過這種方法，使研究者研究那些不能人工培養(yǎng)微生物成為可能。這種方法的合理性在于，可以讓一些自然生長(zhǎng)因子通過擴(kuò)散進(jìn)入到培養(yǎng)室內(nèi)，從而有助于培養(yǎng)室內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)。結(jié)果表明，通過這種方法分離到的細(xì)菌大大超過了傳統(tǒng)分離方法得到的細(xì)菌。Nichols等設(shè)計(jì)并測(cè)試一種分離芯片(Ichip)(圖3)，先把中央平板浸到目標(biāo)細(xì)胞懸液中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)而轉(zhuǎn)到瓊脂培養(yǎng)基中，等培養(yǎng)基冷卻后固定下來，平板兩邊附上薄膜經(jīng)過擠壓彼此分開(圖3)。通過這種芯片分離得到約40%海水微生物種類和50%土壤微生物種類，其中海水樣品中具有62個(gè)(28.3%)、土壤樣具有86個(gè)(28.7%)純培養(yǎng)微生物的16SrRNA基因相似性小于95%。這個(gè)方法可以用于大量且多樣性高的微生物的分離培養(yǎng)。Jung等開發(fā)了一種新技術(shù)，采用I-tip方法使微生物和自然界的化學(xué)物質(zhì)混合稀釋進(jìn)而能夠讓微生物在自然環(huán)境中利用這些物質(zhì)生長(zhǎng)，利用原位培養(yǎng)手段培養(yǎng)出更具多樣性的微生物群體，縮小了可培養(yǎng)和未培養(yǎng)微生物間的距離。

圖2擴(kuò)散生長(zhǎng)盒原位培養(yǎng)環(huán)境微生物示意圖

注：A：擴(kuò)散室是由兩個(gè)0.03μm的聚碳酸酯膜及夾在二者之間的墊圈組成的；B：生長(zhǎng)擴(kuò)散室被培養(yǎng)在海洋沉積物的表面.

圖3分離芯片原位培養(yǎng)微生物的示意圖

注：A：將有多孔的中央平板浸到目標(biāo)細(xì)胞懸液中進(jìn)而捕獲單細(xì)胞；多孔中央平板的局部放大圖；分離芯片裝配：上下兩邊帶有多孔的中央平板通過薄膜擠壓中間的平板；B：螺絲用來密封多孔內(nèi)的細(xì)胞；C：分離芯片裝配：上下兩邊帶有多孔的中央平板通過薄膜擠壓中間的平板，螺絲用來密封多孔內(nèi)的細(xì)胞.

2.3細(xì)胞捕獲

2.3.1單細(xì)胞捕獲分離

單細(xì)胞捕獲分離技術(shù)是指利用拉曼光譜儀等設(shè)備對(duì)特征細(xì)胞進(jìn)行分離，進(jìn)而對(duì)其功能進(jìn)行研究。Wang等通過優(yōu)化光路、提高激光強(qiáng)度等方式顯著提高了單細(xì)胞拉曼光譜的采集速度，首次將微生物細(xì)胞拉曼圖譜獲取時(shí)間降低到毫秒級(jí)，為高通量單細(xì)胞拉曼分選奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，結(jié)合激光誘導(dǎo)向前轉(zhuǎn)移(LIFT)原理，發(fā)明了拉曼激活細(xì)胞彈射(Raman-activatedcellejection，RACE)技術(shù)，可用于將特定拉曼表型的單細(xì)胞從復(fù)雜微生物群落中分離，從而獲取其基因組信息。研究人員一直是通過利用如宏基因組學(xué)研究等方法來發(fā)現(xiàn)一些生物體，探討生活在環(huán)境中的微生物群體，它們通常難以或不可能在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行培養(yǎng)。然而利用單細(xì)胞測(cè)序，科學(xué)家將來自單個(gè)細(xì)胞的DNA擴(kuò)增10億倍，破譯了它的基因組，從而為研究從前未知的“微生物暗物質(zhì)”開辟了一條新途徑。美國(guó)能源部下屬聯(lián)合基因組研究所的譚佳·沃克領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)選擇了201種微生物和古生細(xì)菌的細(xì)胞，并閱讀了其部分基因組(從10%到90%不等，取決于不同細(xì)胞)。這些微生物來源于9種不同的生存環(huán)境，包括海底熱水流火山口以及地下金礦等，沒有一種曾被測(cè)序或在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)過。研究人員通過選擇高度多樣化的微生物，測(cè)定了部分的基因組序列(范圍從低于10%到高于90%，這取決于細(xì)胞)，來嘗試探索這些暗物質(zhì)(圖4)。通過序列闡明了這些微生物之間，以及與其他物種之間的關(guān)系。在新數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，作者提出了對(duì)古生菌域和細(xì)菌域的分類修正，包括提議將古菌重新歸入三個(gè)“超級(jí)門”。通過應(yīng)用單細(xì)胞捕獲分離技術(shù)能夠直接分離單細(xì)胞，進(jìn)而研究細(xì)菌多樣性。

2.3.2熒光激活細(xì)胞分離技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是一種熒光依賴的細(xì)胞表征技術(shù)，也被廣泛用來進(jìn)行微生物細(xì)胞的分離。單個(gè)細(xì)胞在強(qiáng)光源(激光或激光二極管)前面通過時(shí)，可以利用單個(gè)細(xì)胞的特性(如大小、形狀、細(xì)胞熒光信號(hào)等)快速分析整個(gè)細(xì)胞群體。當(dāng)把特異的熒光信號(hào)(如FACS)與細(xì)胞分選結(jié)合起來后就可以對(duì)來自復(fù)雜環(huán)境樣品的大量細(xì)胞進(jìn)行快速分析，如含有FISH探針的個(gè)體就能夠從這個(gè)群體中被分揀出來。Ozawa等利用流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)(FACS)從水樣中檢測(cè)和分離低濃度的微生物，有31種致病菌被分離出來[48]。Podar等對(duì)不可培養(yǎng)的TM7生物門的細(xì)菌群體進(jìn)行研究。他們利用原位熒光雜交技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合的方式對(duì)土壤樣品中的單一細(xì)胞以及小批量細(xì)胞(5?100個(gè))進(jìn)行分離，接著對(duì)一些屬于TM7門的細(xì)菌基因組片段進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，發(fā)現(xiàn)采用該方法可以從土壤群落中篩選到低頻率(0.02%)的靶細(xì)胞，表明該方法可以用來識(shí)別和分離群落中“無(wú)法看到的”稀有物種的代表性微生物[49]。

圖4單細(xì)胞測(cè)序工作流程

注：A：每個(gè)細(xì)胞裂解后進(jìn)行基因組擴(kuò)增產(chǎn)生3300個(gè)成功的擴(kuò)增序列.大部分屬于新譜系的單一擴(kuò)增基因組被用于基因組測(cè)序和草圖組裝，最終得到201個(gè)基因組草圖.

Kvist等從環(huán)境樣本提取細(xì)胞后，使用Cy3標(biāo)記的探針進(jìn)行熒光原位雜交。用顯微操縱器將標(biāo)記有明亮螢光信號(hào)的單細(xì)胞分離，并用單個(gè)分離的細(xì)胞作為多重置換擴(kuò)增的模板(圖5)。多重置換擴(kuò)增的產(chǎn)物隨后用于16SrRNA基因序列分析。結(jié)果顯示>99%16SrRNA基因與土壤泉古菌SCA1170分支具有同源性。用此方法分離了一株土壤泉古菌。但是應(yīng)用該方法有兩個(gè)限制因素，一是存在序列偏差，盡管各種改進(jìn)的策略正在逐步減少這些缺陷，高覆蓋率、高保真性及高特異性的擴(kuò)增仍然是亟待解決的問題；二是由于核糖體RNA很強(qiáng)的進(jìn)化保守性，從而導(dǎo)致以其為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)生分析的分辨率比較低，如16SrRNA基因就無(wú)法完整地表征菌株(基因型)的特性。因此，我們必須進(jìn)一步改進(jìn)這種技術(shù)的操作過程，以尋求更為有效的方法來減少非靶向生物體及外源DNA的污染等情況的發(fā)生。另外，對(duì)測(cè)序得到的大數(shù)據(jù)的分析也是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。

圖5利用熒光原位雜交進(jìn)行單細(xì)胞分離和擴(kuò)增的原理圖

注：A：探測(cè)到特定的目標(biāo)單細(xì)胞后被顯微操縱器分離，其基因組作為模板利用多重置換擴(kuò)增技術(shù)用于基因組擴(kuò)增.

2.4高通量分離培養(yǎng)

2.4.1培養(yǎng)組學(xué)

培養(yǎng)組學(xué)是一種通過增加培養(yǎng)條件來檢測(cè)細(xì)菌多樣性的高通量方法。首先利用血液培養(yǎng)基富集，隨后在瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)。在這一過程中，確認(rèn)了3種成分是必需的：在血液培養(yǎng)瓶中預(yù)培養(yǎng)(分離到56%的新菌種)、瘤胃液的添加(分離到40%新菌種)以及羊血的添加(分離到25%的新菌種)。Lagier等借助微生物培養(yǎng)組學(xué)(Culturomics)，綜合多重培養(yǎng)條件、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)及16SrRNA基因測(cè)序技術(shù)，極大地改善了培養(yǎng)條件，增加了可培養(yǎng)微生物的數(shù)量。同時(shí)，選擇最佳的培養(yǎng)條件來增加研究樣本的數(shù)量和應(yīng)用新的實(shí)驗(yàn)方法(新鮮樣本的接種；小菌落的檢測(cè)和變形菌門、微需氧菌和嗜鹽性的原核生物)來解決之前研究存在的不足。通過這種方法，鑒定出1057個(gè)原核生物物種，其中531種屬于人體腸道菌群；利用培養(yǎng)組學(xué)，首次分離得到的腸道微生物種類至少增加了一倍(圖6)。

圖6培養(yǎng)組學(xué)工作的原理圖

注：A：培養(yǎng)組學(xué)是一項(xiàng)綜合多重培養(yǎng)條件、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)及16SrRNA基因測(cè)序技術(shù).

2.4.2微液滴培養(yǎng)法

Zengler等設(shè)計(jì)了一個(gè)非常精妙的方法，將細(xì)胞包埋在凝膠微滴板中，在低營(yíng)養(yǎng)的流動(dòng)培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，再用流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)微滴板上有多少個(gè)微克隆(圖7)。這是一個(gè)開放流動(dòng)的系統(tǒng)，微生物間的代謝產(chǎn)物及信號(hào)分子可在凝膠空隙中進(jìn)行擴(kuò)散而被其他菌利用。這與自然環(huán)境有很多的相似之處，因而新培養(yǎng)出來的微生物種類也大大增加。這種方法可用于土壤和海水等環(huán)境，并且能夠在每個(gè)環(huán)境樣本中分離得到10000多個(gè)細(xì)菌和真菌。Jiang等借助微液滴平板劃線技術(shù)研究微生物的多樣性。從多環(huán)芳烴富集的土壤微生物群落中分離培養(yǎng)單細(xì)胞，得到4個(gè)分枝桿菌分離株和1種之前未知的降解熒蒽的芽球菌屬。該方法與之前的微液滴方法相比，不需要昂貴的自動(dòng)化設(shè)備來產(chǎn)生微液滴，并且操作簡(jiǎn)單易行。此外，通過組合油相載體，這個(gè)方法能夠被應(yīng)用到其他方面，例如將油脂、石油和能溶于油相的疏水性底物，例如不溶于水的除草劑、殺蟲劑和其他疏水環(huán)境污染物結(jié)合，能夠分離和識(shí)別具有生物修復(fù)和生物轉(zhuǎn)化的環(huán)境微生物。美國(guó)東北大學(xué)的工程師EdgarGoluch和生物學(xué)家SlavaEpstein開發(fā)出一種微型納米設(shè)備，用來從物種混合物中捕獲單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，產(chǎn)生這些細(xì)胞的純培養(yǎng)可以解決微生物培養(yǎng)中的局限性。這種新型設(shè)備可以使單一的細(xì)菌細(xì)胞通過通道進(jìn)入到包含有細(xì)菌“食物”的小室中，而細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)入的顯微通道，僅比細(xì)菌細(xì)胞稍窄一些。因此，當(dāng)進(jìn)入一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞后，就可以阻斷其余細(xì)胞的進(jìn)入。在小室中細(xì)菌的細(xì)胞就可以開始增殖，當(dāng)其增殖到純種樣本并且充滿整個(gè)箱體后，研究者就會(huì)對(duì)其進(jìn)行收集和鑒定。該設(shè)備的優(yōu)勢(shì)是養(yǎng)料室的收縮尺寸和營(yíng)養(yǎng)成分可以動(dòng)態(tài)調(diào)整，進(jìn)而增加捕獲細(xì)胞的多樣性，或者優(yōu)化特定性狀物種的分離。

圖7基于單細(xì)胞包埋在凝膠微滴板中的高通量培養(yǎng)方法流程圖

注：A：將細(xì)胞包埋在凝膠微滴板中，在低營(yíng)養(yǎng)的流動(dòng)培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，再用流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)微滴板上有多少個(gè)微克隆.

2.4.3生物反應(yīng)器培養(yǎng)法

Amanullah等采用目前一種新型的自動(dòng)化小規(guī)模生物反應(yīng)器，通過構(gòu)建適宜的pH、溶解氧和葡萄糖的條件進(jìn)行流加培養(yǎng)，能夠成功地模擬搖瓶和生物反應(yīng)培養(yǎng)條件，相較于傳統(tǒng)方法可以實(shí)現(xiàn)更高濃度的活細(xì)胞培養(yǎng)，濃度至少可達(dá)12×106cells/mL。為了能夠從貧營(yíng)養(yǎng)海洋生態(tài)系統(tǒng)中培養(yǎng)未培養(yǎng)微生物，Connon等利用高通量培養(yǎng)方法在低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行分離培養(yǎng)。研究人員使用將微量滴定板和新開發(fā)的細(xì)胞芯片相結(jié)合的方法，檢測(cè)限能達(dá)到103cells/mL。從近岸海水中收集的樣本中，至少14%的細(xì)胞利用這個(gè)方法能夠被培養(yǎng)。與傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法相比，培養(yǎng)的數(shù)量要高14?1400倍。在培養(yǎng)出的微生物中，4種獨(dú)特的細(xì)胞譜系屬于之前未培養(yǎng)的海洋厚壁菌門。這個(gè)方法在培養(yǎng)已知的海洋克隆文庫(kù)中未培養(yǎng)的海洋浮游微生物是有效的。

3未培養(yǎng)微生物應(yīng)用前景

未培養(yǎng)微生物在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的百分比(約99%)，無(wú)論是其物種類群，還是新陳代謝途徑、生理生化反應(yīng)、產(chǎn)物等方面都存在著不同程度的新穎性和豐富的多樣性，因而其中勢(shì)必蘊(yùn)含著巨大的生物資源，具有非?？捎^的應(yīng)用前景。首先，在生物降解方面，廈門大學(xué)微生物研究所的實(shí)驗(yàn)室從在生態(tài)環(huán)境中尋找未培養(yǎng)微生物及其降解基因的角度出發(fā)，應(yīng)用宏基因組技術(shù)構(gòu)建文庫(kù)，在尋找抑制赤潮藻類的相關(guān)基因及PAHs高效降解基因已進(jìn)行了大量研究，已取得初步研究成果，期望在未培養(yǎng)微生物中尋找高效功能基因并應(yīng)用于污染的生態(tài)環(huán)境治理。其次，在藥物篩選方面，Ouyang利用瓊脂糖凝膠包埋法從中國(guó)南海的多種海綿中分離得到超過400kb大小的細(xì)菌DNA片段，并用獲得的大片段DNA構(gòu)建了海綿Halichondriasp.的BAC文庫(kù)。此外，在酶類資源發(fā)掘方面，多位科學(xué)家利用功能性篩選可以快速地從多個(gè)克隆子中鑒定出全長(zhǎng)基因，并由此獲得這些功能基因的產(chǎn)物，為工業(yè)、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)提供一些新的天然活性物質(zhì)如各種酶類及一些次生代謝產(chǎn)物等，包括4-羥基丁酸脫氫酶、N-?；野彼岷铣擅浮锥≠|(zhì)酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、酯酶等。

4總結(jié)與展望

目前為止，因?yàn)閱渭兊幕驕y(cè)序無(wú)法解答微生物群落功能和代謝，因此，分離未培養(yǎng)微生物的方法越來越受微生物學(xué)者關(guān)注。然而，傳統(tǒng)的方法存在分離效率低、操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴或缺乏群體交互作用等缺點(diǎn)，難以分離特定功能微生物(群)。因此，本文綜述了改良培養(yǎng)基、共培養(yǎng)、原位培養(yǎng)、單細(xì)胞捕獲分離、熒光激活細(xì)胞分離技術(shù)、培養(yǎng)組學(xué)、微液滴培養(yǎng)法等新方法，并且提出必要時(shí)可幾種培養(yǎng)手段相結(jié)合，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，從多個(gè)角度對(duì)未培養(yǎng)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)。同時(shí)，我們要發(fā)掘未培養(yǎng)微生物豐富的基因資源，發(fā)現(xiàn)新的酶類和化合物?；谝陨涎芯楷F(xiàn)狀，筆者認(rèn)為，未來還應(yīng)在以下幾個(gè)方面加強(qiáng)研究：

（1）筆者實(shí)驗(yàn)室從事瘤胃微生物分離培養(yǎng)研究工作多年，在厭氧滾管技術(shù)和調(diào)整培養(yǎng)基等方面均進(jìn)行了很多探索，目前通過富集培養(yǎng)已成功從奶牛瘤胃中分離得到具有TVA氫化能力的微生物菌株一株；從瘤胃壁上分離得到地衣芽孢桿菌和奇異變形菌，從瘤胃液中分離獲得白色瘤胃球菌、溶糊精琥珀酸弧菌和布氏密螺旋體，總共5種尿素分解菌，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)瘤胃微生物提供理論依據(jù)和方法基礎(chǔ)。同時(shí)，我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了一種基于短序列的引物設(shè)計(jì)來定量差異細(xì)菌的方法，并成功運(yùn)用了基于短的16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)的引物定量目標(biāo)未培養(yǎng)細(xì)菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與飼喂混合粗飼料的奶牛瘤胃微生物相比，飼喂秸稈粗飼料的奶牛瘤胃中顯著減少的未培養(yǎng)細(xì)菌R-UB來源于Succinivibrionaceae，有助于我們通過針對(duì)性地調(diào)控瘤胃微生物來更好地利用秸稈粗飼料資源。此外，我們利用自主研發(fā)的人工瘤胃模擬系統(tǒng)，以尿素和脲酶抑制劑(乙酰氧肟酸)分別作為尿素分解菌的激活劑和抑制劑，通過高通量測(cè)序技術(shù)研究細(xì)菌16SrRNA基因變化，揭示瘤胃優(yōu)勢(shì)尿素分解菌群。最終揭示了瘤胃優(yōu)勢(shì)尿素分解菌：Pseudomonas、Streptococcus、Haemophilus、Bacillus、Neisseria、Actinomyces和Succinivibrionaceae[60]。該研究解決了純培養(yǎng)難題，這對(duì)于胃腸道重要功能菌群的鑒定提供了新的研究思路。另外，奶牛瘤胃尿素分解菌群的鑒定，為調(diào)控瘤胃尿素代謝和提高尿素氮利用率提供了新的調(diào)控靶標(biāo)。但是一方面由于我們?nèi)匀蝗狈?duì)微生物的多樣性、生存環(huán)境以及在生物進(jìn)化中地位的認(rèn)識(shí)，無(wú)法設(shè)計(jì)微生物生長(zhǎng)的原位環(huán)境實(shí)現(xiàn)群體培養(yǎng)，導(dǎo)致依賴其他微生物的代謝活動(dòng)或者其他環(huán)境條件中的微生物不能生長(zhǎng)。另一方面，緩慢生長(zhǎng)的或稀有的微生物經(jīng)常在培養(yǎng)和測(cè)序的過程中被豐度相對(duì)高的微生物所掩蓋。因此還需繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)微生物生理環(huán)境的分析研究，解析影響未培養(yǎng)微生物不能培養(yǎng)的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)因子。

（2）雖然以共培養(yǎng)、原位培養(yǎng)、單細(xì)胞捕獲分離、熒光激活細(xì)胞分離技術(shù)、培養(yǎng)組學(xué)、微液滴培養(yǎng)法等為代表的分離培養(yǎng)技術(shù)近年來迅速發(fā)展，但一些常規(guī)方法(如傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法、厭氧滾管技術(shù)、改良培養(yǎng)基等)也不能完全摒棄。應(yīng)該將多種技術(shù)相結(jié)合，為探究環(huán)境中微生物分布和多樣性，解析不同環(huán)境條件下微生物生態(tài)功能，挖掘環(huán)境中未培養(yǎng)微生物，更新和完善微生物數(shù)據(jù)庫(kù)等提供新的方法學(xué)支持。

（3）必須全面理解微生物生理適應(yīng)性與群體行為，發(fā)展和革新培養(yǎng)技術(shù)，改變微生物培養(yǎng)方式，設(shè)計(jì)盡可能接近微生物生活的自然環(huán)境，培養(yǎng)出更多的“不可培養(yǎng)微生物”，推動(dòng)來源于未培養(yǎng)微生物的新基因、新活性物質(zhì)和天然產(chǎn)物等資源的挖掘利用。

文獻(xiàn)來源微生物學(xué)通報(bào)DOI:10.13344/j.microbiol.china.170356作者：邢磊趙圣國(guó)（轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）