微流控芯片上酶和免疫反應(yīng)

1. 微流控芯片上非均相酶和免疫反應(yīng)

芯片上酶和抗體的固定化就是通過化學(xué)或物理方法 ,使原來水溶性的酶或抗體與聯(lián)結(jié)在微管道管壁的水不溶性固態(tài)支持物相結(jié)合或被載體包埋。固定方法有物理吸附、交聯(lián)、共價結(jié)合及包埋法等。酶和抗體經(jīng)固定化處理后一般穩(wěn)定性有較大提高 ,可重復(fù)利用 ,分析成本降低 ,而且適于連續(xù)自動分析。與電極表面、孔板、磁性微珠、玻璃管等敞開體系中蛋白質(zhì)固定不同,在微尺寸封閉體系的芯片微管道中固定酶或抗體,操作難度更大;而微流控芯片上酶和抗體的固定化對微管道的構(gòu)型要求不高 ,往往直接采用常規(guī)的T型和Y型微管道。因此 ,研究的重點在于如何有效地實現(xiàn)酶和抗體的固定化 ,目前僅有為數(shù)不多的酶或抗體固定方法成功地轉(zhuǎn)移到了微流控芯片上[13 ] 。

（1）馬來酐衍生物或戊二醛固定酶

戊二醛或馬來酐衍生物是研究得較為深入的酶 或抗體的交聯(lián)劑。其中戊二醛處理過的載體具有醛 功能模板 ,與蛋白質(zhì)分子發(fā)生不可逆共價結(jié)合 ,而馬 來酐衍生物使蛋白質(zhì)分子與載體以肽鍵方式結(jié)合。 Lee 等 [14 ]分別用這兩種固定方法 ,將大豆過氧化物 酶(soybean peroxidase ,SBP) 固定在修飾的玻璃材質(zhì) T 型微管道表面 ,進(jìn)行了對甲酚的雙氧水酶催化氧化 反應(yīng) ,并同時固定脂肪酶ΠSBP ,實現(xiàn)了微流控芯片上 對甲苯基醋酸鹽的多級酶催化氧化反應(yīng)。也有報道 用 APTES (32aminopropyltriethoxysilane) [15 ] 對玻璃或 PDMS 管道表面進(jìn)行氨基功能化處理 ,然后再通過 與羧基的共價結(jié)合來固定抗體。

（2）溶膠2凝膠固定化酶

溶膠2凝膠固定化酶是將酶分子固定在高聚物 格子里 ,這種固定化酶的機(jī)械強(qiáng)度較大 ,酶分子不易 脫落。Kato 等 [16 ]在標(biāo)準(zhǔn) DNA 分析芯片的進(jìn)樣儲液 池中制備豬胰島素膠囊凝膠來固定胰蛋白酶 ,進(jìn)行 了精氨酸乙酯和酪蛋白的水解及在線的熒光檢測。 Jin 等 [17 ]利用凝膠微珠固定胰蛋白酶 ,進(jìn)行酶的水 解及電泳分離和質(zhì)譜檢測。Huang 等 [18 ] 利用比表面 積較大的納米粒子對 PMMA 管壁進(jìn)行修飾后 ,通過 凝膠固定胰蛋白酶[19 ] 。

（3）微珠固定酶或抗體

磁性高分子微球是指內(nèi)部含有磁性金屬或金屬 氧化物的超細(xì)粉末而具有磁響應(yīng)的高分子微球。它是近20年來發(fā)展起來的新型高分子材料 ,除了具有 納米顆粒的特性外,還可以通過表面的官能團(tuán)進(jìn)行各種功能修飾,用來固定酶或抗體,而且表面具有磁性,在外加磁場的作用下可以進(jìn)行分離,用于蛋白質(zhì)的分離和純化,因此在生物樣品分析提純和臨床檢驗領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。目前在微流控芯片上微球主要是作為酶或抗體的載體,發(fā)展成熟的磁性微球或沒有磁性的玻璃微球在微流控芯片上都有應(yīng)用[20 —22] 。

磁性瓊脂糖微珠被 Srinivasan 等 [23 ]用來在 PDMS 微管道內(nèi)固定 Pikc 羥化酶 ,進(jìn)行鐵氧化還原蛋白催 化大環(huán)內(nèi)脂化合物的羥化反應(yīng) ,70nlΠmin 流速的反 應(yīng)產(chǎn)率可達(dá) 90 %。玻璃微珠經(jīng)烷基氨修飾后可與 抗體通過戊二醛結(jié)合 , Tsukagoshi 等 [24 ] 利用這一方 法在電泳芯片樣品儲液池中固定抗人血清蛋白 ,進(jìn) 行競爭免疫反應(yīng)后 ,反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離和化學(xué) 發(fā)光檢測。測得人血清白蛋白(HSA) 含量為319gΠL。 同樣的方法 ,在玻璃珠表面固定羊抗人血清 (anti2 IAP) ,測得血清中癌癥標(biāo)記物 IAP 含量為 272mgΠL。

Sato 等 [25 ,26 ] 用聚苯乙烯微珠固定干擾素抗體 , 此系統(tǒng)的特點是采用反應(yīng)管道中的壩式結(jié)構(gòu)將微珠 固定(圖 1) 。注入干擾素 (IFN) 進(jìn)行免疫反應(yīng) ,再與 維生素 E 聯(lián)結(jié)的羊抗2重組 IFN 多克隆抗體聯(lián)結(jié) ,用 膠狀金粒標(biāo)記后 ,進(jìn)行產(chǎn)物的熱透鏡檢測。芯片設(shè) 計為四通道 ,可以同時測定 4 個樣品 ,4 個樣品從反 應(yīng)到分析總共需要 50min ,檢測限達(dá)到0101ngΠml ,而 常規(guī)方法每個樣品就要 35min。這種方法利用微流 控芯片的高通量及靈活的流體操作來處理酶聯(lián)免疫 反應(yīng) ,可以大大節(jié)省檢測時間及試劑消耗。Kim 等 [27 ]利用結(jié)合了抗體的順磁性納米顆粒與熒光標(biāo) 記聚苯乙烯微珠通過抗原2抗體作用力發(fā)生吸附 ,在 外界磁場作用下分離 ,進(jìn)行了兔和鼠免疫球蛋白的 測定。Luo 等 [28 ]將金納米粒子作為抗原蛋白載體沉 積在 PDMS 管壁 ,進(jìn)行了羊抗人 IgG的測定 ,檢測靈 敏度達(dá)到 10 ngΠml。

圖 1 非均相酶聯(lián)免疫反應(yīng)芯片[25 ,26 ]

Fig. 1 Microchip of inhomogeneous ELISA[25 ,26 ]

（4）硝化纖維膜固定酶

纖維素結(jié)構(gòu)中存在大量羥基 ,可通過氧化、酯化、醚化和交聯(lián)等各種反應(yīng)進(jìn)行功能化處理 ,用于酶 或抗體的固定。Park 研究組[29 ] 將市售硝化纖維膜 經(jīng)過溶解再成型 ,通過不可逆疏水作用力將β2牛乳 糖與膜吸附固定 ,固定化的酶位于十字型電泳芯片 管道交叉口下游 (圖 2) ,當(dāng)樣品流經(jīng)酶固定床的時 候與之發(fā)生反應(yīng) ,然后產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離。進(jìn)行了 FDG(fluorescein di2β2D2galactopyranoside) 的β2牛乳糖 降 解 反 應(yīng) 和 FMG ( fluorescein mono2β2D2galact2 opyranoside) 與β2牛乳糖的酶反應(yīng)動力學(xué)研究 ,測得 的 Km = 11217 ,與其他報道值 117 接近。

圖 2 非均相衍生反應(yīng)電泳芯片結(jié)構(gòu)[29 ]

Fig. 2 Structures of CE2microchip for inhomogeneous reactions[29 ]

（5）原位聚合固定酶

Mersal 等 [30 ] 用硅烷化試劑 (γ2MAPS) 修飾玻璃 芯片微管道 ,在進(jìn)樣管道中通過原位聚合的方法制 作固定有葡萄糖氧化酶的聚酰胺整體柱 ,作為柱前 反應(yīng)器 ,進(jìn)行了果汁中葡萄糖的酶反應(yīng)及電泳分離、 安培檢測。這種固定化酶可以連續(xù)使用 8h 而不失 活。Qu 等 [31 ] 報道了在硅烷化試劑 (XPS) 修飾過的 PMMA 微管道中通過原位聚合的方法制作硅膠整體 柱來固定牛血清白蛋白 ,用作質(zhì)譜檢測的衍生處理芯片。

（6）其它固定方法

Phillips 等 [32 ,33 ] 用膠囊融合的方法在等離子體 氧化處理過的 PDMS 管壁上引入卵磷脂雙分子層 膜 ,可以使表面的浸濕性大為改善。將霍亂病毒綁 定在膜上 ,然后與兔抗2霍亂病毒發(fā)生免疫反應(yīng) ,再 聯(lián)結(jié)熒光標(biāo)記的二抗后進(jìn)行熒光檢測。接觸角測定 顯示雙分子層膜處理的 PDMS 管壁親水表面可保持 幾小時。Wells 等 [34 ]提出了一種新的 Y型微管道中 酶的固定方法 : 在壓力驅(qū)動的微管道中施加與壓力 梯度相反的電場 ,利用這種競爭作用力將靶蛋白β2 乳球蛋白捕獲并固定在負(fù)極區(qū)域 ;然后依次注入 DDT(dithiothreitol) 分解二硫鍵 ,碘乙酰胺使巰基丙氨 酸烷烴化 ,胰島素和蛋白質(zhì)降解酶水解 ;多步反應(yīng)后 反接電場 ,將產(chǎn)物沖出管道進(jìn)行質(zhì)譜檢測 (圖 3) 。 此外 ,還有報道利用高聚物管壁與蛋白質(zhì)的非特異 性結(jié)合力固定葡萄糖氧化酶[35 ] ,兩性磷脂聚合物或 多分子層膜固定胰蛋白酶[36 ,37 ] ,動態(tài)橡膠微珠固定 地高辛單克隆抗體[38 ] ,以及在 PDMS 聚合物材料里 面添加生物素2磷脂 ,用于固定鏈霉素[39 ] 。

圖 3 電場固定化酶反應(yīng)微流控芯片[34 ]

 Fig. 3 Enzyme solidification by electric field on microchip[34 ]

2.微流控芯片上均相酶和免疫反應(yīng)

非均相酶和免疫反應(yīng)雖然可以提高酶和抗體的 利用率 ,但是芯片上蛋白質(zhì)的固定化難度較大 ,而且 固定化都會一定程度上改變酶或抗體的分子結(jié)構(gòu) , 影響其反應(yīng)活性 ;而均相反應(yīng)會大大提高分子的傳 質(zhì)能力 ,縮短生化反應(yīng)的時間且沒有復(fù)雜的蛋白質(zhì) 固定化程序。微流控芯片超微量的樣品消耗以及靈 活的流體操作也更適合于均相反應(yīng)。因此 ,微流控 芯片上更適合于集成各種類型的均相生化反應(yīng)過 程 ,其研究的重點在于如何通過合理微管道構(gòu)型設(shè) 計進(jìn)行反應(yīng)液流的操縱。也有報道采用多相流或微 液滴技術(shù)進(jìn)行酶反應(yīng)[40 ,41 ] ,其液流控制技術(shù)難度較 大 ,目前來看 ,用于實際的樣品分析尚需一定的時 間 ,本文對這部分內(nèi)容不做詳細(xì)介紹。

（1）微管道柱前反應(yīng)

直接在離線的微反應(yīng)管中進(jìn)行酶或免疫反應(yīng) , 然后將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到電泳芯片上進(jìn)行電泳分離和 檢測是芯片上生化反應(yīng)集成的最初設(shè)想。TNT和單 · 228 · 化 　學(xué) 　進(jìn) 　展 第 19 卷 克隆 TNT抗體及熒光素標(biāo)記三硝基苯的競爭免疫 反應(yīng)產(chǎn)物[42 ] ,以及重組破傷風(fēng)毒素 C 片段(CTTC) 與 單克隆破傷風(fēng)病毒 C 片段抗體 (anti2TTC) 及熒光標(biāo) 記的牛血清白蛋白競爭免疫反應(yīng)產(chǎn)物[43 ] 已經(jīng)被成 功轉(zhuǎn)移到電泳芯片上進(jìn)行分離和檢測。Caliper 公司 的Lin 等 [44 ]設(shè)計的芯片(圖 4) 用來進(jìn)行熒光標(biāo)記底 物與磷酸脂酶的反應(yīng) (在孔板上進(jìn)行) ,然后進(jìn)行 MEKC分離 ,測定酶的活性 ,通過抑制劑滴定進(jìn)行高 通量篩選。這種方法實際上并沒有真正地將生化反 應(yīng)集成到微流控芯片上 ,只是利用了電泳芯片的分 離功能 ;而且在反應(yīng)產(chǎn)物由反應(yīng)器轉(zhuǎn)移至電泳芯片 的過程中勢必造成試劑的損耗 ,這個不連續(xù)的過程 可能對最終的分析造成誤差。

圖 4 多通道電泳芯片[44 ]

Fig. 4 Multi2channel CE2microchip[44 ]

直接在電泳芯片樣品貯液池中進(jìn)行的酶和免疫 反應(yīng)一定程度上避免了這個問題。利用這一設(shè)計方 法 ,Starkey 等 [45 ]在電泳芯片的樣品儲液池中進(jìn)行β2 葡糖甘酸酶與熒光標(biāo)記的單2β2D2葡萄糖甘酸反應(yīng) , 然后經(jīng)電泳分離和熒光檢測 ,進(jìn)行酶的抑制分析。 Abad2Villar 等 [46 ]結(jié)合非接觸式電導(dǎo)檢測進(jìn)行了人免 疫球蛋白 IgM 的直接免疫分析。Wang 等 [47 ] 使用普 通的十字型電泳芯片 ,在樣品貯液池進(jìn)行對氧磷、對 硫磷和甲基對硫磷的有機(jī)磷水解、酶降解反應(yīng)生成 電化學(xué)活性的硝基酚磷酸酯 ,反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳分離 和電導(dǎo)檢測。他們還將葡萄糖氧化酶加入到緩沖液 中 [48 ] ,在分離管道中酶與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)生成葡萄 糖酸和 H2O2 ,實現(xiàn)了葡萄糖、尿酸、維生素 C 和對乙 酰氨基酚的同步檢測。Schwarz[49 ] 在電泳運(yùn)行緩沖 液中添加葡萄糖氧化酶 ,催化有機(jī)胺的循環(huán)氧化 ,增 強(qiáng)安培檢測信號。這些在貯液池或分離管道中進(jìn)行 的生化反應(yīng)和后續(xù)的檢測雖然是連續(xù)的 ,但這些反 應(yīng)器都是非流動式的 ,沒有任何流體的擾動 ,反應(yīng)程 度也是不可控制的 ,反應(yīng)物僅通過簡單的分子擴(kuò)散 混合 ,傳質(zhì)較慢 ,需要反應(yīng)時間較長。但對某些酶和 免疫快反應(yīng) ,由于可以簡化芯片設(shè)計 ,這種反應(yīng)方法 也經(jīng)常被人們采用。

設(shè)計柱端反應(yīng)器是電泳芯片上酶和免疫反應(yīng)最 常用也是最有效的手段。因為微流控芯片上靈活多 變的流路設(shè)計使得生化反應(yīng)可控性更強(qiáng) ,從反應(yīng)尤 其是多步反應(yīng)到分離檢測一系列連續(xù)操作過程 ,大 大節(jié)省了分析時間 ,微尺寸的反應(yīng)管道可節(jié)省昂貴 的生化試劑。因此 ,這一領(lǐng)域的研究相當(dāng)活躍。柱 端反應(yīng)管道設(shè)計的出發(fā)點是通過優(yōu)化混合反應(yīng)管道 的構(gòu)型和尺寸使反應(yīng)物充分混合 ,靈活的液流操作 保證反應(yīng)程度的可控性以及多通道集成進(jìn)行平行檢 測 ,避免多次操作帶來的偏差。

目前 ,芯片上柱前均相酶和免疫反應(yīng)管道總體 上分為敞開式[50 ,51 ]和封閉式[52 ,53 ]兩種。所謂敞開式 柱前反應(yīng)器就是酶或免疫反應(yīng)在芯片上的樣品貯液 池中進(jìn)行。但與上述非流動式反應(yīng)器不同 ,各種反 應(yīng)試劑是通過與樣品池相連的試劑貯液池分別引入 的。這種反應(yīng)器中分子的傳質(zhì)較慢 ,需要較長的停 留反應(yīng)時間 ,而且敞開的反應(yīng)器會造成試劑的揮發(fā)。 報道最多的是封閉式的反應(yīng)管道。理論上 ,微混合 器的原理都適用于柱前反應(yīng)器 ,但過于復(fù)雜的柱前 反應(yīng)操作不利于后續(xù)的分離分析 ,因此柱前反應(yīng)器 多采用簡單的被動混合原理?！癟”和“Y”型兩種混 合管道結(jié)構(gòu)簡單、制作難度小 ,是目前微流控分析芯 片上應(yīng)用最為廣泛的反應(yīng)管道構(gòu)型[54 ] 。兩液流完 全依靠分子擴(kuò)散來實現(xiàn)混合 ,混合速度取決于混合 管道的寬度和分子的擴(kuò)散系數(shù)?；旌掀魉苓_(dá)到的 混合效率取決于微管道的長度 , 但大多設(shè)計沒有進(jìn) 行優(yōu)化 ,其混合效率也就難以保證。Wang 等 [52 ] 對 柱前“T”型酶反應(yīng)管道(圖 521) 尺寸進(jìn)行了優(yōu)化 ,反 應(yīng)池寬度(200μm) 為進(jìn)樣管道寬度的 4 倍 ,這樣可以 減小反應(yīng)液流的電滲流 ,使反應(yīng)更充分。使用這種 反應(yīng)管道進(jìn)行了葡萄糖、V 型神經(jīng)遞質(zhì)[55 ] 及氨基酸 的柱前反應(yīng)及分離檢測[56 ] 。有限長度的直混合管 道的混合能力畢竟是有限的 ,而折疊彎管既可以延 長混合管道長度 ,又能在彎管處形成二次流擾動混 合液流[57 ] ,增強(qiáng)混合。Cheng 等 [58 ] 的柱前免疫反應(yīng) 器(圖 522) 和 Cohen 等 [54 ]的柱前酶反應(yīng)器(圖 523) 利 用了這一原理 ,在“Y”型混合管道中增加了“U”型折 疊彎管來增強(qiáng)反應(yīng)液流的傳質(zhì)能力。De Boer 等 [59 ]利用同樣的原理設(shè)計了集成有反相色譜分離的組織 蛋白酶 B 的微流控酶反應(yīng)器 ,用于生物活性物質(zhì)的 篩選。Belder 等 [60 ]設(shè)計的柱前酶催化反應(yīng)管道引入 了多個方型彎管來增強(qiáng)混合。

圖 5 集成有 T型和 Y型柱前反應(yīng)器的電泳芯片[52 ,54 ,58 ]

Fig. 5 CE2microchips with T or Y pre2column reactors[52 ,54 ,58 ]

我們通過計算機(jī)模擬計算發(fā)現(xiàn) ,引入 3 個“U” 型折疊彎管的混合管道的混合效率比等長的“Y”型 直混合管道高 20 %。十字型混合管道可以同時注 入 3 種反應(yīng)物液流形成夾流混合 ,進(jìn)行反應(yīng) ,適合于 酶的抑制分析和競爭免疫分析。Roper 等 [5 ] 采用十 字型柱前反應(yīng)管道(圖 621) 將胰島素和 FITC 標(biāo)記的 胰島素與抗胰島素抗體同時引入反應(yīng)管道進(jìn)行競爭 免疫反應(yīng)分析。Hadd 等 [61 ] 用 T 型混合器作為酶底 物的稀釋管道 ,在稀釋管道下游設(shè)計了十字型管道 用于酶、底物和酶抑制劑的混合反應(yīng)(圖 622) 。

圖 6 集成有十字型柱前反應(yīng)器的電泳芯片[5 ,61 ]

Fig. 6 CE2microchip with cross shaped pre2column reactor[5 ,61 ]

多級層流混合器有著很高的混合能力 ,雖然目 前還沒有將其用作酶或免疫反應(yīng)器的報道 ,但已被 用作生物胺的芯片電泳柱前熒光標(biāo)記反應(yīng)管道[7 ] (圖 7) 。我們研究組通過計算機(jī)模擬發(fā)現(xiàn) ,對混合 液流進(jìn)行 4 次拆分的多級層流混合器 ,羅丹名 6G在 6mm 的混合距離內(nèi)可以達(dá)到 99 %的混合效率 ,遠(yuǎn)遠(yuǎn) 高于其它構(gòu)型的被動混合器。

圖 7 集成有多級層流柱前反應(yīng)器的電泳芯片[7 ]

Fig. 7 CE2microchip with multi2channel pre2column reactor[7 ]

柱前均相反應(yīng)需要靈活精確的液流控制來保證 反應(yīng)和分離檢測的同時進(jìn)行以及準(zhǔn)確的進(jìn)樣。在壓 力驅(qū)動的芯片裝置上 , Kerby 等 [62 ] 根據(jù)流體力學(xué)計 算設(shè)計網(wǎng)絡(luò)管道 ,利用管道寬度的不同(10 —100μm) 來控制流體阻力 ,進(jìn)行反應(yīng)液流控制。在電驅(qū)動微 流控芯片裝置上 ,根據(jù)電流和試劑流量的定量關(guān)系 , 通過調(diào)節(jié)電流的大小和方向來控制反應(yīng)試劑的稀釋 濃度以及液流的流向是較為常用的方法[54 ,61 ,63 ] ,也 是比較容易實現(xiàn)的。為了使柱前反應(yīng)和分離檢測同 時進(jìn)行 ,反應(yīng)管道和分離管道需要設(shè)計成獨(dú)立的流 路 [54 ] 。Roper 等 [5 ]設(shè)計了單個電源控制的免疫電泳 芯片 ,用來檢測由胰島分泌的胰島素。反應(yīng)管道和 · 428 · 化 　學(xué) 　進(jìn) 　展 第 19 卷 分離管道采用并聯(lián)式設(shè)計 ,使用同一個廢液池(圖 62 1) ,反應(yīng)和分離過程同時進(jìn)行 ,15s 內(nèi)可完成整個分 析過程。對于有些較慢且需要加熱的酶反應(yīng) ,要使 反應(yīng)充分進(jìn)行 ,可以采用溶液停留技術(shù)使反應(yīng)物在 加熱區(qū)域滯留 ,控制反應(yīng)時間使之反應(yīng)完全[64 ,65 ] 。 門式進(jìn)樣是集成有柱前反應(yīng)器電泳芯片系統(tǒng)最理想 的進(jìn)樣方法 ,這種進(jìn)樣技術(shù)可以滿足反應(yīng)和進(jìn)樣的 快速切換。

微流控分析芯片多次操作重復(fù)性較差一直困擾 著眾多研究者 ,尤其是集成了柱前反應(yīng)之后 ,復(fù)雜的 流體操作更難以保證分析結(jié)果的重現(xiàn)性 ,這對于需 要多次平行測定的酶反應(yīng)動力學(xué)滴定分析及競爭免 疫分析是極為不利的。集成多通道的微流控分析芯 片單次操作就可以完成一系列的滴定操作 ,彌補(bǔ)了 這一缺陷。Cheng 等 [58 ]設(shè)計了六通道的集成免疫反 應(yīng)電泳芯片(圖 522) ,用來進(jìn)行卵清蛋白(ovalbumin) 和抗卵清蛋白的免疫反應(yīng)和熒光掃描檢測。Kang 等 [51 ]將高通量的微流控混合反應(yīng)器與孔板中熒光 顯影檢測相結(jié)合 ,利用壓力驅(qū)動的濃度梯度混合器 使酶底物形成一系列濃度 ,同時平行注入下游孔板 中 ,與從相反方向注入的堿性磷酸酶在孔板中反應(yīng) , 然后通過孔板熒光顯影進(jìn)行檢測 ,一次操作就可以 完成酶的滴定(圖 8) 。這種方法巧妙地結(jié)合了微流 圖 8 酶活性滴定分析微流控芯片[51 ] Fig. 8 Microchip used for enzyme activity titration[51 ] 控芯片靈活的流體處理能力和生物芯片的高通量平 行檢測的優(yōu)點。Duffy 等 [66 ]設(shè)計了 48 通道的圓盤式 芯片系統(tǒng) ,在離心力驅(qū)動下進(jìn)行茶堿的酶抑制動力 學(xué)研究 ,一次操作就可以完成 3 次平行滴定 (15 個系列濃度) ,總的分析時間為 3min。多通道集成的 酶抑制分析和競爭免疫分析微流控芯片裝置 ,很大 程度上降低了常規(guī)實驗室操作以及單通道微流控操 作多次測量引入的偏差 ,大大縮短了分析時間。但 是也必須看到 ,有限面積的芯片上集成了大量的樣 品池 ,手工加樣操作較煩瑣 ,而且很容易造成試劑污 染 ,這也是集成芯片系統(tǒng)需要解決的問題之一。

圖 8 酶活性滴定分析微流控芯片[51 ]

Fig. 8 Microchip used for enzyme activity titration[51 ]

（2）微管道柱后反應(yīng)

柱后反應(yīng)會直接導(dǎo)致樣品分離譜帶的展寬 ,影 響電泳分離的柱效。但是有些反應(yīng) ,如蛋白質(zhì)的熒 光標(biāo)記[65 ] 、化學(xué)發(fā)光衍生反應(yīng)[67 —69 ] ,有時不得不采 用柱后衍生。Liu 等 [70 ]在電泳芯片上設(shè)計了柱后化 學(xué)發(fā)光衍生管道 ,采用螢火蟲熒光素Π熒光素酶生物 發(fā)光體系 ,對大腸桿菌細(xì)胞萃取液進(jìn)行了 ATP 及 ATP 代謝物的檢測(圖 9) 。蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記反應(yīng) 一般發(fā)生在氨基或其它活性基團(tuán)上 ,蛋白質(zhì)分子中 多個反應(yīng)點的存在 ,可衍生出多種電泳淌度不同的 物質(zhì) ,而且熒光染料與氨基的吸附使得蛋白質(zhì)分子 淌度差減小 ,更難以進(jìn)行電泳分離 ,因此蛋白標(biāo)記多 采用柱后衍生[71 ] 。

圖 9 集成有柱后反應(yīng)器的電泳芯片[70 ]

Fig. 9 CE2microchip with post2column reactor[70 ]

同時集成有柱前和柱后反應(yīng)器的電泳芯片 (圖 1021) [64 ] ,對管道設(shè)計和電壓的施加方式都有很高的 要求。首先流路的設(shè)計必須保證反應(yīng)和分離過程不 相互沖突 ,各種試劑不交叉污染 ,緩沖液的 pH 值不 影響酶或抗體的活性以及能夠通過控制電壓來控制 各種試劑的流量。最重要的問題是如何通過優(yōu)化管 道的設(shè)計 ,使柱前和柱后反應(yīng)不至引入太大的柱效 損失。

Wang 等 [3 ]在電泳芯片上集成柱前反應(yīng)器進(jìn)行 酶標(biāo)記抗體(抗人胰島素) 和抗原(胰島素) 的免疫反 應(yīng)及葡萄糖脫氫酶 ( GDH) 和葡萄糖在輔酶 (NAD+ ) 存在下的酶反應(yīng) ,電泳分離后在柱后反應(yīng)管道中進(jìn) 行堿性磷酸酶和其底物 ( p2nitrophenyl phosphate ( p2 NPP) ) 的衍生反應(yīng) ,安培檢測 NADH 和 p2NP 產(chǎn)物 (圖 1022) 。用同樣的裝置 ,在柱前反應(yīng)器進(jìn)行磷酸 酯酶標(biāo)記抗體(anti2mouse IgG) 和抗原 (mouse IgG) 的 免疫反應(yīng) ,然后電泳分離免疫復(fù)合物和未反應(yīng)的抗 第 5 期 徐 　溢等 　微流控分析芯片上生化反應(yīng)技術(shù)研究進(jìn)展 · 528 · 體 ,在柱后進(jìn)行酶示蹤物質(zhì)與 42aminophenyl (PAPP) 磷酸底物衍生化反應(yīng) ,生成電化學(xué)活性的 42氨基酚 (PAP) 進(jìn)行安培檢測。分析表明抗體和抗原的電遷 移率相差較大 , 柱前柱后反應(yīng)導(dǎo)致明顯的譜帶 展寬[72 ] 。

圖 10 同時集成柱前和柱后反應(yīng)管道的電泳芯片[3 ,64 ]

Fig. 10 Electrophoresis microchips integrated both pre2and post2column reaction channels[3 ,64 ]

目前關(guān)于混合管道的研究已經(jīng)相當(dāng)深入 ,人們 提出了各種用來提高混合器混合效率的方法[73 —75 ] 。但是可以看出 ,真正用于微流控分析芯片上混合反 應(yīng)的設(shè)計只有被動混合器 ,而且也只是最簡單的T型或Y型管道結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)的混合反應(yīng)管道 ,其 混合效率實際上是有限的。微流控分析芯片最終的 目的是分析 ,復(fù)雜的反應(yīng)處理會影響測定的重復(fù)性 , 降低分離柱效。如何權(quán)衡這兩者的關(guān)系將是微流控 芯片研究者需要解決的問題。

微流控芯片上酶聯(lián)免疫反應(yīng)

酶聯(lián)免疫分析(ELISA) 最常見的是在 96 孔板上 進(jìn)行。常規(guī)的 ELISA 由于其單調(diào)費(fèi)時的處理過程 , 經(jīng)常導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。分析過程中需要一系列的混 合和清洗過程 ,由于每一步都要較長的溫育時間 ,一 次分析經(jīng)常需要兩天的時間 ,這個時間是由于抗體Π 抗原較低的傳質(zhì)效率造成的 ,而免疫反應(yīng)本是快反 應(yīng)。微流控芯片高通量和流體驅(qū)動方便的特點已使 越來越多的研究者嘗試著將 ELISA 轉(zhuǎn)移到微流控芯 片上來進(jìn)行[76 —78 ] 。Lai 等 [79 ] 設(shè)計了圓盤形離心力驅(qū) 動的 96 通道 ELISA 分析微流控裝置(圖 1121) ,用來 進(jìn)行鼠雜種瘤培養(yǎng)細(xì)胞中鼠 IgG抗體分析。每個通 道上有 11 個貯液池用來引入反應(yīng)物和洗脫液 ,在每 個貯液池下方設(shè)計毛細(xì)管閥進(jìn)行液流控制 ,精確的 管道幾何設(shè)計使單個儲液池中的溶液充滿檢測池而 不泄露到其它液池。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速 ,離心力和毛細(xì)作用力相互競爭分別完成每一步反應(yīng)和相應(yīng)的清洗 過程[79 ] 。每步反應(yīng)試劑消耗為 1μl ,整個分析時間 降到了 30min。

圖 11 酶聯(lián)免疫(ELISA) 衍生反應(yīng)微流控裝置[79 ,80 ]

Fig. 11 Microfluidic devices of ELISA derivatization[79 ,80 ]

肉毒菌神經(jīng)毒素是毒性最大的底物 ,人的致死 量為 1ngΠkg。使用常規(guī)治療方法需要 4 天的時間 , 而目前肉毒菌中毒最有效的治療方法就是中毒后盡 快處理毒素 ,但必須在毒素和神經(jīng)結(jié)合之前(24h) 進(jìn) 行。芯片上的檢測可大大縮短檢測時間。Moorthy 等 [80 ]用他們設(shè)計的 ELISA 微流控裝置 (圖 1122) 直 接檢測全血樣品中的肉毒菌神經(jīng)毒素。該裝置集成 了混合器、水凝膠濾膜以及閥門 ,實現(xiàn)了過濾、混合、 溫育和樣品預(yù)處理過程。為了檢測類毒素 ,在鏈鎖 球菌處理的瓊脂糖膠微珠上固定維生素 H 抗體 ,第 二抗體上的磷酸酯酶與酶底物反應(yīng)生成不溶的有色 · 828 · 化 　學(xué) 　進(jìn) 　展 第 19 卷 沉淀包覆在微珠上 ,使裸露的染料便于檢測。使用 這個裝置可以檢測到全血中臨床相關(guān)量的毒素。

微流控芯片上含氮氧化物檢測的反應(yīng)

含氮氧化物在生理學(xué)上是很重要的信號化合 物 ,包括神經(jīng)傳遞、血管舒張和發(fā)炎等癥狀。含氮氧 化物可轉(zhuǎn)化成硝酸鹽和亞硝酸鹽混合物 ,最常用的 檢測方法是 Griess 反應(yīng)。Hanajiri 等 [81 ] 在電泳芯片 樣品池中放置銅包覆的鎘顆粒將樣品中的硝酸鹽轉(zhuǎn) 化成亞硝酸鹽 ,用間接安培檢測法檢測含氮氧化物 釋放劑 (32morpholinosydnonimine) 釋放出的硝酸鹽和 亞硝酸鹽。Goto 等 [82 ] 使用鼠腹膜巨噬細(xì)胞為模型 , 在玻璃芯片上集成了細(xì)胞培養(yǎng)、Griess 反應(yīng)、酶反 應(yīng)、溫度控制以及熱透鏡檢測 ,實現(xiàn)了脂多糖刺激細(xì) 胞釋放氮氧化物的檢測。與常規(guī)的檢測方法相比 , 其總的分析時間由 24h 減少到 4h ,檢測限由 10 - 6 molΠL 降到 7 ×10 - 8 molΠL。

微流控芯片上的 PCR反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)已成為核酸分析的主要方法 ,被 廣泛用于 DNA 序列擴(kuò)增反應(yīng)、臨床診斷和人類基因 測序等。目前 PCR 微流控芯片主要集中于反應(yīng)功 能芯片的研究。PCR 裝置不但要求巧妙的流路設(shè) 計 ,還需要集成加熱器和溫度傳感裝置[83 ] ,因此 PCR 芯片只用作反應(yīng)功能芯片[84 —86 ] 。Ivonne 等 [8 ] 對 PCR 反應(yīng)功能芯片做了詳細(xì)的綜述。擴(kuò)增產(chǎn)物最終 要進(jìn)行分析檢測 ,產(chǎn)物與電泳分離檢測以及其它檢 測方式接口的研究是非常重要的。本文只討論與芯 片電泳聯(lián)用的集成 PCR 反應(yīng)器。

集成在電泳芯片上的 PCR 反應(yīng)器與 PCR 反應(yīng) 功能芯片不同 ,因為它必須兼顧電泳分離過程 ,而電 泳分離過程在溫度要求上剛好與需要循環(huán)加熱的 PCR 反應(yīng)相反 ,要達(dá)到較高的分離柱效 ,分離管道系 統(tǒng)的溫度應(yīng)盡可能低。這就要求 PCR 反應(yīng)器僅在 反應(yīng)區(qū)域局部加熱 ,而且要有良好的散熱功能。最 簡單的設(shè)計是直接在樣品池中進(jìn)行 PCR 反應(yīng) ,將整 個芯片放在常規(guī)循環(huán)加熱器上進(jìn)行加熱和控 溫 [87 ,88 ] 。利用這種加熱方法 Dunn 等設(shè)計了用來測 定老鼠基因多態(tài)現(xiàn)象的 PCR 電泳芯片 (圖 1222) 。 這種設(shè)計實際上并沒有將 PCR 反應(yīng)集成到電泳芯 片上 ,從反應(yīng)到分離過程的操作也是不連續(xù)的。 Hataoka 等 [89 ]使用標(biāo)準(zhǔn) DNA 芯片 ,在片上加工了鋁 片加熱器 ,進(jìn)行前列腺特征抗體碎片的擴(kuò)增及電泳 分析。珀耳帖(Peltier) 是很成熟的一種微電子元件 ,可直接貼在 PCR 反應(yīng)管道上很方便地實現(xiàn)局部溫 度控制。Wook 等 [90 ]制作的 T 型 PCR 柱前反應(yīng)器使 用了這種加熱元件 ,熱電偶帖在片上用作溫度傳感 , 進(jìn)行 λDNA 擴(kuò)增及產(chǎn)物的凝膠電泳分離檢測。 Lagally 等 [91 ]在 PCR 電泳芯片上通過電沉積加工金 加熱器和 Pt 溫度傳感器 ,進(jìn)行病原體和大腸桿菌的 基因擴(kuò)增和電泳分離檢測(圖 1221) 。這種制作方法 才是真正意義上的 PCR 電泳芯片 ,因為它完全從電 泳芯片的整體結(jié)構(gòu)出發(fā) ,設(shè)計并制作 PCR 柱前反應(yīng) 器 [92 ] 。

圖 12 PCR 產(chǎn)物檢測電泳芯片[88 ,91 ]

Fig. 12 Electrophoresis microchip for PCR products detection[88 ,91 ]

PCR 反應(yīng)需要較長時間 ,反應(yīng)過程中必須保證 反應(yīng)物保持在反應(yīng)室而不流到其它管道 ,而且擴(kuò)增 產(chǎn)物一般需要進(jìn)行凝膠電泳分離 ,在分離管道充入 凝膠的過程中還必須保證其不進(jìn)入 PCR 反應(yīng)室。 這就要求在反應(yīng)室和分離管道之間設(shè)計閥門。緊縮 管道是較為常用的停止閥[87 ,90 ] ,即在反應(yīng)管道過渡 到分離管道的區(qū)域設(shè)計一段寬度很小的過渡管道 , 窄管道的流體阻力可起到閥的作用。Lagally 等 [91 ] 制作了 PDMS 膜閥來控制樣品的位置 ,對進(jìn)樣管道 和 PCR 反應(yīng)池的幾何構(gòu)型進(jìn)行了優(yōu)化 ,準(zhǔn)確控制篩 分介質(zhì)進(jìn)入分離管道。

結(jié)論與展望

綜上所述 ,越來越多的生物化學(xué)反應(yīng)被集成到 微流控芯片上。酶和免疫反應(yīng)的高特異性、PCR 反 應(yīng)的信號增強(qiáng) ,以及其它反應(yīng)的靈活性與微流控裝 置的高通量、低試劑消耗、靈活的流路設(shè)計和高集成 能力相結(jié)合 ,一改傳統(tǒng)實驗室生化分析和臨床診斷 第 5 期 徐 　溢等 　微流控分析芯片上生化反應(yīng)技術(shù)研究進(jìn)展 · 928 · 所存在的操作過程不連續(xù)、廢時和成本高等缺點。 但也必須看到 ,生化反應(yīng)在微流控分析芯片上的集 成還處在快速發(fā)展階段 ,尚不成熟。芯片操作的重 復(fù)性較差 ,芯片上生化反應(yīng)的可控性不強(qiáng) ,集成能力 還不夠高是微流控芯片發(fā)展亟待解決的問題?？梢?肯定的是 ,集成有生化反應(yīng)的微流控分析芯片正在 朝著臨床診斷、藥物篩選、核酸分析和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng) 域快速發(fā)展 ,并顯示出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。

文獻(xiàn)來源：中圖分類號 : O652 ; R39211 ; Q55 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 : A 文章編號 : 10052281X(2007) 0520820212 作者：徐溢，呂君江，范偉，溫志渝

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