微流控技術(shù)在精子優(yōu)選中的應(yīng)用
傳統(tǒng)精子優(yōu)選方法包括上游法、密度梯度離心法，主要根據(jù)沉降和遷移速度選擇活力和形態(tài)正常的精子，與體內(nèi)重重篩選機制相差較大，且分選時間過長、離心操作過多易導(dǎo)致精子DNA過氧化損傷和斷裂，精子質(zhì)量降低，影響ART成功率。因此，建立簡單、快速、無/低損傷的精子優(yōu)選新方法已成為提高輔助生殖技術(shù)(ART)成功率的迫切需求。微流控技術(shù)的應(yīng)用正適應(yīng)了這一需求，穩(wěn)定的流體環(huán)境可最大程度地避免精子機械損傷。
臨床上精子優(yōu)選主要依賴于精子活力和形態(tài)兩項指標。目前微流控技術(shù)進行精子活力評價與篩選的方法有微通道篩選、介電電泳力篩選及層流效應(yīng)篩選。
微通道篩選是通過形成穩(wěn)定流體，使精子在流體中自由游動，不涉及過多的人為操作，故非常直接且減少/避免DNA機械損傷。
國外團隊曾設(shè)計單一直通道、分枝級聯(lián)通道、存在障礙物的通道等系列芯片對人精子計數(shù)及活力測定。結(jié)果顯示，精子朝一個方向游動且能穿越寬40、100、120 um的單一直通道，高活力精子能穿越較長通道，精子亦可通過分枝級聯(lián)的彎曲通道。同時他們進行了精子功能測定，如穿透宮頸粘液，與透明質(zhì)酸、殺精劑和抗人IgG抗體的作用等，證明微流控技術(shù)評價精子功能的有效性和多面性。他們通過改進芯片結(jié)構(gòu)，進樣池經(jīng)2條或4條彎曲通道與收集池連接，通過精子到達收集池的時間判斷精子活性，實現(xiàn)分級評價。該方法與 Makler 計數(shù)板依據(jù)精子前向運動分級評價結(jié)果相關(guān)性良好，高活力精子( 3 級、3+級)至收集池耗時360～ 480 s，低活力精子( 1級、1+級、2級) 耗時660～770 s。該實驗以精子評價為主，不以精子篩選為目的。
McCormack等設(shè)計直通道利用熒光標記技術(shù)進行精液樣本受精能力篩查實驗。參照WHO標準，活力精子濃度、前向運動精子濃度篩查實驗結(jié)果顯示，該系統(tǒng)熒光信號與二者濃度皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別是0.79、0.80，靈敏度分別是94%、96%，特異性分別是97%、90%，但該裝置價格昂貴且熒光標記復(fù)雜，限制其廣泛應(yīng)用。
Seo等依據(jù)精子逆流游動的特性優(yōu)選公牛、小鼠、人精子。實驗時通道A、B、C內(nèi)流體分別流向交叉點、儲液池2、儲液池3，儲液池2通入精液樣本，活力精子逆流穿越通道B到達交叉點，再被高速流體輸送到儲液池3，實現(xiàn)精子優(yōu)選。特別是該法分選3份公牛精子，精子活力由平均18.4%提高到78.8%。依據(jù)相同原理，Chen等設(shè)計一款便攜型精子質(zhì)量分析儀，該系統(tǒng)集成庫爾特技術(shù)進行精子計數(shù)，評價精子活力及濃度兩項指標。實驗證明電壓脈沖數(shù) 0～335分別對應(yīng)臨床用血球計0～19*10^6/ml、精子質(zhì)量分析儀精子活力指數(shù)0～204。本系統(tǒng)無需熒光標記、成本低、操作方便，且無需樣本預(yù)處理，但計數(shù)孔尺寸較小 (寬6 um)。
微流控技術(shù)在精子優(yōu)選中的應(yīng)用
微流控技術(shù)在精子優(yōu)選中的應(yīng)用
Han等設(shè)計陣列微壩連接兩微室簡易結(jié)構(gòu)實現(xiàn)活力精子篩選，且集成穩(wěn)定可靠的控溫模塊。結(jié)果顯示該系統(tǒng)較培養(yǎng)箱及室溫更適合精子，同時該系統(tǒng)集成倒置光學(xué)顯微鏡可用于精子評價、胚胎培養(yǎng)及體外受精(IVF)研究。
運動速度最快的精子未必是受精能力最強的精子，故精子分級捕獲及評價有利于男性不育癥的診斷及精子生理特性研究。Qiu 等設(shè)計不同通道截面實現(xiàn)各區(qū)段流速不同，在各流速區(qū)段分別捕獲與其相匹配的活力精子，統(tǒng)計各區(qū)段精子數(shù)目得到各級活力精子百分率。作者分別捕獲了平均直線速度( 40.5±3.0)、( 27.2±0.6) 、( 18.7±0.6) μm / s的活力精子。
直通道篩選精子簡單方便，且與生理環(huán)境接近，但目前尚無公認的尺寸標準。謝蘭以出口池精子相對數(shù)量和精子活力作為評價標準，通過熒光標記精子驗證直通道篩選效果。寬度篩選通道：長7mm，深25μm，寬200μm、500μm、1mm及1. 5mm；長度篩選通道：寬1mm，深25μm，長5mm、7mm、1cm及1. 5cm；獲得最佳通道寬度和長度，優(yōu)化通道深度： 深25μm、50μm、100μm及200μm；獲得最佳通道寬、長、深，優(yōu)化篩選時間5 min、15 min、30 min及60 min。當(dāng)寬1 mm、長7 mm、深25μm的直通道，經(jīng)15 min篩選的ICR小鼠精子不僅活力更高 ( 82.6±2.9 ) %且互相分散，有助于提高IVF的成功率。
微通道篩選只是單純依據(jù)精子的游動優(yōu)選精子，不能完全反映生理狀態(tài)下精子的自然優(yōu)選過程。鐘志敏等在芯片上模擬生理狀態(tài)下精子與宮頸粘液相互作用，實現(xiàn)精子的自然優(yōu)選和精子質(zhì)量在線檢測。本方法用時短、無需離心，且優(yōu)選的精子在精子活力、平均軌跡速度、前向性比例、正常形態(tài)百分率等指標均優(yōu)于分選前及上游法，同時也為芯片上模擬生理狀態(tài)下的受精過程奠定基礎(chǔ)。
微通道篩選精子簡單易用，與生理環(huán)境接近，且對精子的傷害小，故其臨床應(yīng)用前景非常廣泛，同時活力篩選通道也有集成后續(xù)受精相關(guān)器件的潛力，為在芯片上實現(xiàn)IVF的全過程奠定基礎(chǔ)。
介電電泳技術(shù)(dielectrophoresis，DEP)是指細胞在不均一交變的電場中被誘導(dǎo)極化，不同的細胞由于介電特性、電導(dǎo)率、形狀或大小等不同而感應(yīng)出不同的偶極矩，因此在電場中受到不同的介電力而得以分離。
Fuhr等通過施加不同高頻電場實現(xiàn)不同活性的人單精子捕獲、定位和篩選。在石英和玻璃基 質(zhì)上制作超微電極，當(dāng)外界鹽溶液的電導(dǎo)率大于精 子的平均電導(dǎo)率時，負向介電電泳作用形成，精子由電極處被推向電場最小處。在平面4電極或三維8電極區(qū)域施加高頻交流電，形成向心推斥力，快速游動的精子可以被捕獲數(shù)秒 (電場＞500V / cm、頻率MHz時，部分精子停止運動)以便監(jiān)測；采用條狀電極及叉指電極，速度約40～70μm / s的精子將被固定在斷點電極處數(shù)分鐘。該系統(tǒng)亦可以將捕獲的幸存精子釋放至特定區(qū)域以便集成后續(xù)實驗操作。
當(dāng)通道尺度進入微米量級、流體雷諾數(shù)低時，相互靠近且平行的兩股層流僅靠擴散作用實現(xiàn)混合。層流穩(wěn)定后，在表面張力和粘滯力的作用下使活力精子從原液中穿過層流界面游至收集通道中，無活力精子及細胞碎片保留在原液中流動直至排出，從而實現(xiàn)精子活力篩選。
Cho 等集成水平式重力驅(qū)動微泵基于層流效應(yīng)實現(xiàn)人精子篩選，克服使用傳統(tǒng)重力微泵時流速隨時間不斷降低的缺陷。3個樣本經(jīng)篩選后精子活力均接近100% ，精子正常形態(tài)率從 ( 9.5±1.1) % 提高到( 22.4±3.3 ) % ，活力精子回收率分別為39%、42%、43%。該系統(tǒng)集成度高、分選效率高，且樣品量僅需50μl( 常規(guī)精子優(yōu)選方法難以操作) 。Schuster等從實踐上證明了層流效應(yīng)篩選精子的低損傷功能，但該系統(tǒng)精子回收率并不高，且篩選效率有待進一步提高。同未處理、連續(xù)離心法、密度梯度離心法、上游法相比，Schulte等證明了層流效應(yīng)篩選的精子活力最高 (分別是52.0%、50.1%、73.4%、85.8%、96.2%，P＜0.0001)，DNA損傷率最低 (分別是13.3%、15.8%、14.9%、5.7%、1.9%，P＜0.05)。王維等考察層流原理分選的精子質(zhì)量，同上游法相比，精子DNA 損傷率明顯下降，且活力、正常形態(tài)率及尾部腫脹率均有顯著提高。后對自行設(shè)計的三通道芯片(樣品通道居兩側(cè))的通道入口角度及分選通道寬度進行優(yōu)化。3種通道入口角度 ( 30°、45°、60°) 和3種通道寬度( 120、180、250 μm)的芯片分選的精子活力和正常形態(tài)率均無顯著差異，但入口角度30°、分選通道寬250 μm時，分選效率最高。
微流控技術(shù)在精子優(yōu)選中的應(yīng)用
Wu等采用聚乙二醇甲基丙烯酸酯表面改性聚二甲基硅氧烷( Polydimethylsiloxane，PDMS) 精子優(yōu)選芯片，親水性長時間( 56 d) 穩(wěn)定，非特異性吸附極小、有效避免通道堵塞，且通道表面易浸潤、利于進樣，篩選的人精子活力為74%。
PDMS 因安全無保證、石英因成本高均不適合臨床應(yīng)用，Matsuura等采用臨床領(lǐng)域已認可的環(huán)烯烴聚合物制作精子篩選芯片，經(jīng)過篩選，精子活力由53.0%提高到90%，線性速度由廢液池的( 21. 0±1.7)μm / s 增大至收集池的( 51.7±2.1)μm / s ( n = 172)、( 59.5±1.6 )μm /s( n = 79 )，且提高了ART成功率，但活動精子回收率較低 ( 0.2%～0.3% )。
Tseng等采用熒光染料SYBR-14 / PI標記人精子，通過注射泵進樣，依據(jù)層流效應(yīng)篩選活力精子，并用顯微鏡觀察不同活力的精子，流式細胞儀鑒別及量化死/活精子。該系統(tǒng)流速可控、穩(wěn)定，且精子篩選效率提高(精子存活率94.8% )。
優(yōu)化的層流效應(yīng)精子活力篩選芯片，可有效篩選高活力精子，對于未處理的精液，尤其是含有大量碎片的精液有著極其重要的應(yīng)用價值。由于此方法不能篩選特定流速的精子，且流速限制不能篩選大量精液，同時目前此方法的應(yīng)用有限，未見對中重度少弱精液樣本的處理效果和在ART中的應(yīng)用效果的報道。
微流控技術(shù)優(yōu)選精子具有分選效率高、精子DNA損傷少、操作簡便且分選時間短的優(yōu)點，在ART 中無論是IVF 和 ICSI 中精液參數(shù)正常還是輕度少弱精子癥的精子優(yōu)選都將具有良好的應(yīng)用前景。
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