作者：余韓潔鈺&周子琦

幾乎所有組織都是由多種類型的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）集成的3D結(jié)構(gòu)。組織功能的實(shí)現(xiàn)，需要細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)，以及細(xì)胞與周圍ECM相互作用。肝臟是由排列在3D支架原代肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等組成的。

目前研究者們也用很多不同的方式構(gòu)建了3D肝模型，包括小型的多孔培養(yǎng)系統(tǒng)、3D細(xì)胞打印、3D細(xì)胞成型等。它大都是將肝細(xì)胞與其他細(xì)胞在微模式的3D支架中培養(yǎng)，當(dāng)異型細(xì)胞之間足夠近時(shí)，會(huì)產(chǎn)生生化相互作用，它們之間相互協(xié)調(diào)，從而實(shí)現(xiàn)改善的肝特異性功能。但這些技術(shù)可能在均勻性、可移植性和數(shù)量方面受到一定限制。所以本文想要做能夠精確控制的3D結(jié)構(gòu)中的不同細(xì)胞組成的多功能人類微組織。

本文報(bào)道了通過在生物相容性的3D核-殼凝膠支架中控制異型細(xì)胞的組裝，如下圖所示，基于微流控技術(shù)來產(chǎn)生高度單分散的結(jié)構(gòu)，在液滴中創(chuàng)建人造肝臟。研究者制造水-水-油（w / w / o）雙重乳液，并將其用作模板，成功地將3D核-殼支架與肝細(xì)胞整合到殼中的成纖維細(xì)胞包圍的核心中。

圖1 原理圖

如圖2b和2c所示，微流控芯片的內(nèi)相是細(xì)胞培養(yǎng)基，中相是藻酸鹽水溶液，其中有Ca-EDTA復(fù)合物，由于雷諾數(shù)低，內(nèi)相與中相共流，在交匯處由于氟化碳油，形成單分散的由水性核心和水凝膠殼組成的液滴。下游引入了一種額外的油流，該油流包含0.15％的乙酸，并觸發(fā)藻酸鹽溶液中Ca 2+從Ca-EDTA復(fù)合物中釋放出來；隨后，二價(jià)Ca 2+與藻酸鹽鏈的兩個(gè)不同羧基結(jié)合，形成交聯(lián)的3D網(wǎng)絡(luò)，如圖2a。文中還通過用熒光素標(biāo)記藻酸鹽，進(jìn)行熒光共聚焦顯微鏡觀察，得出單分散核-殼液滴的直徑為169±6μm。

圖2 a) 通過觸發(fā)Ca2+從Ca-EDTA復(fù)合物中釋放而使藻酸鹽網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)。b)PDMS設(shè)備的示意圖。c) 使用w / w / o雙乳液作為模板制備核-殼液滴。d) 使用基于液滴的微流體產(chǎn)生的單分散核-殼液滴。

為了將肝細(xì)胞組裝在核心中，將肝細(xì)胞預(yù)混在內(nèi)相的培養(yǎng)基中，其被凝膠殼包裹在核心中，經(jīng)過幾天的培養(yǎng)開始出現(xiàn)聚集體，如圖3a所示。同樣的，當(dāng)把成纖維細(xì)胞預(yù)混在海藻酸鹽溶液的中間相時(shí)，其就被海藻酸鹽網(wǎng)絡(luò)限制在殼中，并且在核中沒有觀察到細(xì)胞，如圖3b所示。為了模擬人類肝臟3D結(jié)構(gòu)，將肝癌細(xì)胞HepG2組裝在被成纖維細(xì)胞NIH-3T3包圍的核心中。該研究中，通過殼中藻酸鹽的原位交聯(lián)形成球體，并將球體快速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)基中，把細(xì)胞暴露于弱酸性條件是有限的，并且對(duì)細(xì)胞活力幾乎沒有影響。如圖3c多為活細(xì)胞（綠色），幾乎沒有死細(xì)胞（紅色）。   

圖3 3D核-殼支架中不同細(xì)胞的空間組裝a) 凝膠殼將HepG2細(xì)胞限制在核心中。b)通過交聯(lián)的藻酸鹽網(wǎng)絡(luò)固定在殼中的NIH-3T3成纖維細(xì)胞。c) 肝細(xì)胞在核心中同時(shí)組裝，在殼中成纖維細(xì)胞同時(shí)組裝，形成一滴人造肝臟。（比例尺100μm，細(xì)胞活力通過鈣黃綠素AM /EthD-1染色試劑盒進(jìn)行表征。）

如圖4，在37°C的培養(yǎng)基中培養(yǎng)核-殼球體，兩周后仍保持其球形，在此期間細(xì)胞變得更致密。將其凍干，在掃描電子顯微鏡下頁觀察到了明顯的球形。此外，冷凍干燥的球體的橫截面顯示出核心中的密集細(xì)胞聚集體和殼中的分散細(xì)胞。海藻酸鹽水凝膠的外殼堅(jiān)固耐用，同時(shí)具有很高的滲透性，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物能夠通過。交聯(lián)海藻酸鹽的水凝膠殼在機(jī)械上是堅(jiān)固的，將其存儲(chǔ)于-80°C下，依然能在37°C不破壞結(jié)構(gòu)或影響細(xì)胞活力的情況下再次培養(yǎng)。經(jīng)過10天的培養(yǎng)，細(xì)胞也基本都是活的，沒有死細(xì)胞出現(xiàn)（紅色）。14天后，細(xì)胞活力略有下降，作者解釋說，可能因?yàn)榧?xì)胞增殖產(chǎn)生了高細(xì)胞密度，核心處有低氧狀況出現(xiàn)。

圖4 在核-殼球體中共培養(yǎng)肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。a-c) 肝細(xì)胞在核心和殼中的成纖維細(xì)胞分別共培養(yǎng)1天，7天和14天。隨著時(shí)間的推移，保持其球形形態(tài)。d-e)SEM圖像。f) 在核-殼結(jié)構(gòu)中空間受限的細(xì)胞集合。g）在-80℃下凍兩周然后在37℃下融化之后，封裝在球狀體中的細(xì)胞的高存活力。h）封裝在球體中的細(xì)胞共培養(yǎng)10天顯示出高細(xì)胞活力。i）培養(yǎng)14天的細(xì)胞的活力略有下降。

為了在一滴中測(cè)量微組織的肝臟特異性功能，隨時(shí)間監(jiān)測(cè)其白蛋白分泌和尿素合成。白蛋白和尿素是肝臟的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。用相同數(shù)量的肝細(xì)胞培養(yǎng)了兩個(gè)樣品，一個(gè)在核-殼結(jié)構(gòu)中，殼中有成纖維細(xì)胞，另一個(gè)沒有成纖維細(xì)胞，并分別使用白蛋白和尿素檢測(cè)試劑盒監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中白蛋白和尿素的濃度。相比肝細(xì)胞的單型培養(yǎng)單獨(dú)，肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)的核殼球狀體的白分泌和尿素合成都增加了，表明3D微型共培養(yǎng)與傳統(tǒng)的單型細(xì)胞培養(yǎng)相比，有了顯著增強(qiáng)的肝臟特異性功能。

圖5 肝細(xì)胞/成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)和肝細(xì)胞培養(yǎng)的肝臟特異性功能的測(cè)定。在七天內(nèi)測(cè)量的HepG2 / NIH-3T3共培養(yǎng)和HepG2培養(yǎng)的a)白蛋白分泌和b）尿素合成。

總之，本文使用基于液滴的微流控技術(shù)，將肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分層組裝成3D核-殼支架，在每個(gè)液滴中形成人造肝臟。并表明嵌入3D核-殼支架中的肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)是體外肝臟的良好模型。具有同型和異型細(xì)胞間相互作用的平衡，有利于其表達(dá)肝臟的特定功能。

此外，來自西北大學(xué)合成與天然功能分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的范海明教授團(tuán)隊(duì)利用類似上文的方式，使用實(shí)驗(yàn)室觸手可得的槍頭完成了3D肝細(xì)胞培養(yǎng)，找到了槍頭培養(yǎng)的最適細(xì)胞液體積以及癌相關(guān)成纖維細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的最適比例，并在此基礎(chǔ)上探究了線粒體靶向磁熱療的治療能力。研究中使用了TPP（線粒體受體靶向分子）修飾在磁珠表面實(shí)現(xiàn)對(duì)線粒體的靶向作用。

圖6 肝腫瘤橢球體重建檢測(cè)線粒體靶向磁療治療效果

實(shí)驗(yàn)原理如圖7所示，研究者將規(guī)格為200μL的槍頭一分為二，留下寬大的一部分，將邊緣打磨光滑，將其中注入一定量的成纖維細(xì)胞與肝癌細(xì)胞混合液進(jìn)行培養(yǎng)。在這部分中，研究者對(duì)混合培養(yǎng)液的體積進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞液滴與槍頭切割面夾角a為30°時(shí)，細(xì)胞液體懸浮狀態(tài)最穩(wěn)定，能在槍頭尖端保持較長(zhǎng)時(shí)間，此時(shí)的體積為50μL。

圖7 實(shí)驗(yàn)原理圖。a圖顯示了使用槍頭培養(yǎng)的具體操作；b圖顯示了不同體積的細(xì)胞混合液在槍頭末端與槍頭截面形成的夾角a大?。╝代表80μL，a’代表50μL）；c圖顯示了夾角與細(xì)胞混合液體積的關(guān)系。

在本研究中使用的3T3成纖維細(xì)胞攜帶H2BGFP標(biāo)記物，這使得它們很容易與非熒光HepG2細(xì)胞區(qū)分開來。在亮場(chǎng)和熒光成像中均可觀察到3T3成纖維細(xì)胞，而HepG2只能在亮場(chǎng)下觀察到。利用這一區(qū)別，研究則發(fā)現(xiàn)懸浮液滴中形成的球體具有層狀結(jié)構(gòu)，其中3T3成纖維細(xì)胞形成ECM外殼(綠色熒光)，核心為HepG2(黑色)。結(jié)果模型如下圖8B所示。

圖8 液滴中3T3成纖維細(xì)胞和HepG2細(xì)胞形成的肝球體的結(jié)構(gòu)特征。a圖顯示在液滴中培養(yǎng)3天后，顯示肝臟球體三維構(gòu)象的亮場(chǎng)圖像；b圖為模型示意圖；c圖展示了不同層位(z軸位置)肝球體的熒光圖像顯示，三維肝球體的外層主要由3T3成纖維細(xì)胞構(gòu)成，熒光標(biāo)記物為H2BGFP；d,e圖顯示了在孔板培養(yǎng)7天后，球體逐漸降解。在圖2D中，右側(cè)面板的圖像是區(qū)域1和區(qū)域2的放大圖，顯示了3T3成纖維細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的區(qū)域分布。圖E中的白色箭頭用H2B-GFP熒光標(biāo)記物鑒定3T3成纖維細(xì)胞。

研究者同樣對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行了染色。他們使用CMAC染色肝癌細(xì)胞。與之前GFP標(biāo)記成纖維細(xì)胞的分布重疊發(fā)現(xiàn)，結(jié)論仍與前一致，即肝癌細(xì)胞在中央，成纖維細(xì)胞在周圍。

圖9 TPP-磁珠對(duì)肝癌細(xì)胞生存的影響。a圖顯示了鐵濃度與細(xì)胞存活率的關(guān)系，結(jié)果表明細(xì)胞存活率與鐵含量無關(guān)；b圖顯示了在沒有明顯的細(xì)胞毒性的情況下，添加和不添加TPP涂層的SPIONs的細(xì)胞攝取磁珠的數(shù)量都在孵育4小時(shí)后顯著增加，并在12小時(shí)后趨于飽和，?17pg /cell。長(zhǎng)時(shí)間孵育至24小時(shí)，未見進(jìn)一步增加，說明TPP涂層對(duì)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)SPIONs沒有影響；c圖顯示了對(duì)于磁熱療, TPP- spions可以誘導(dǎo)大約76%的HepG2細(xì)胞死亡，而在沒有TPP涂層的情況下，可以誘導(dǎo)約26%的HepG2細(xì)胞死亡。說明TPP可以很好的靶向線粒體，進(jìn)而通過線粒體的損傷殺死癌細(xì)胞；d,e兩圖是用透射電鏡(TEM)觀察有無TPP包覆的SPIONs在細(xì)胞膜內(nèi)的內(nèi)化和分布。培養(yǎng)12 h后，無TPP包覆的SPIONs主要出現(xiàn)在核內(nèi)體或溶酶體中。然而，TPP-SPIONs進(jìn)入線粒體，并保持球形。說明TPP可以很好的靶向線粒體。

通過消化肝腫瘤球體和測(cè)定鐵的含量來評(píng)估tpp - spions的攝取。結(jié)果與假設(shè)一致，即TPP-SPIONs的入侵受到球殼結(jié)構(gòu)的抑制，F(xiàn)e的攝取量在單層HepG2細(xì)胞中最高(?17pg /cell)，以球殼的形式最低(圖C)。球粒-100(低3T3比，1:10)與單層培養(yǎng)細(xì)胞(3T3比，1:10)相似，說明兩種情況下NPs均可與大多數(shù)細(xì)胞接觸。相比之下，位于球體中心(3T3比1:10)的細(xì)胞被“外殼”阻止與NPs接觸，這是鐵吸收量顯著下降的原因(圖C中的黃色條形圖)。長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)皿培養(yǎng)至24小時(shí)不會(huì)影響細(xì)胞的整體生存能力。假設(shè)每個(gè)細(xì)胞接受相同數(shù)量的NPs，那么在球體培養(yǎng)中與NPs接觸的細(xì)胞數(shù)量約為單層培養(yǎng)細(xì)胞的40%。10分鐘后肝腫瘤球形內(nèi)細(xì)胞的整體活力與鐵的攝取量呈負(fù)相關(guān)(圖D)。在磁熱療過程中，TPP-SPIONs的效率是通過將細(xì)胞活力值正常化為鐵的攝入量來評(píng)估的(圖E)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HepG2細(xì)胞維持單層時(shí)，TPP-SPION誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡最顯著，而當(dāng)處理肝腫瘤球形時(shí)，TPP-SPION誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效果最差。

圖10 用吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)法測(cè)定3T3成纖維細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的存活率，并分析其與肝橢球體組成的關(guān)系（圖片解釋見上文）

總的來說，范海明教授團(tuán)隊(duì)運(yùn)用前人3D細(xì)胞培養(yǎng)的理念，獨(dú)創(chuàng)了基于槍頭的3D球體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，并探究了TPP連接對(duì)于磁熱療的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由成纖維細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共同組成的細(xì)胞球體會(huì)阻礙磁熱療的進(jìn)行，作者推測(cè)是球殼結(jié)構(gòu)中形成的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）微環(huán)境阻礙了肝癌細(xì)胞對(duì)磁珠的攝入，具體原因有待后續(xù)探究。

點(diǎn)評(píng)：1.可以將肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞替代為其他細(xì)胞，以構(gòu)建其他組織模型并研究一般的細(xì)胞間相互作用。  2.作為高通量藥物篩選的體外肝模型，具備一定前景。3.文章2探究了SPIONs與TPP-SPIONs目前存在的問題。

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