微流控芯片(microfluidics)又稱芯片實(shí)驗(yàn)室(labonachip),是將化學(xué)和生物等領(lǐng)域所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等基本操作單元集成到幾個(gè)平方厘米大小的具有微米級(jí)通道結(jié)構(gòu)的芯片上,采用可控流體,完成常規(guī)化學(xué)和生物實(shí)驗(yàn)室的各種功能的一種微技術(shù)平臺(tái)。微流控芯片具有小型化、集成化、高通量、低能耗、分析快速等特性。自20世紀(jì)90年代初,微流控芯片以芯片毛細(xì)管電泳的形式出現(xiàn)以來,目前已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、環(huán)保和新藥研究等領(lǐng)域。

有別于以靜態(tài)親和雜交為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)生物芯片,微流控芯片采用微流體控制技術(shù),為動(dòng)態(tài)生物分析提供了一個(gè)嶄新的技術(shù)平臺(tái)。微流控芯片在生物領(lǐng)域的應(yīng)用可分為分子水平和細(xì)胞水平。細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位,一切有機(jī)體(除病毒外)都由細(xì)胞構(gòu)成,對(duì)細(xì)胞的深入研究是揭開生命奧秘和治療疾病的關(guān)鍵所在。雖然以毛細(xì)管電泳和流式細(xì)胞儀為代表的細(xì)胞分析儀器被普遍應(yīng)用,但功能單一,而且存在各自的不足。例如,毛細(xì)管電泳不易對(duì)細(xì)胞操控和處理,流式細(xì)胞儀耗費(fèi)大量樣品等。微流控芯片在細(xì)胞學(xué)研究方面具有以下一些優(yōu)點(diǎn):第一,微流控芯片通道尺寸(10~100μm)與單個(gè)細(xì)胞直徑(10~20μm)大小相近,便于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行操控;第二,微流控芯片的多維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成相對(duì)封閉的環(huán)境,更接近生理狀態(tài)下細(xì)胞的生存環(huán)境;第三,微流控芯片可以滿足高通量細(xì)胞分析的需要,可同時(shí)獲取大量的生物學(xué)信息;第四,微流控芯片上多種操作單元靈活組合,使得細(xì)胞進(jìn)樣、培養(yǎng)、捕獲、裂解和分離檢測(cè)等過程在一塊芯片上即可完成;第五,微流控芯片為平板式幾何構(gòu)型,更方便進(jìn)行觀察;第六,芯片上傳熱和傳質(zhì)快,有利于熱量和物質(zhì)的擴(kuò)散。由于微流控芯片能在試驗(yàn)條件下模擬生理?xiàng)l件,為在單細(xì)胞和多細(xì)胞水平更好地研究細(xì)胞提供了一個(gè)全新的技術(shù)平臺(tái)。本文對(duì)近年來微流控芯片在細(xì)胞生物學(xué)研究中的一些主要應(yīng)用,包括細(xì)胞的培養(yǎng)、分選、裂解、凋亡、計(jì)數(shù)、遷移、單細(xì)胞捕獲和細(xì)胞間相互作用等進(jìn)行了綜述。

1.細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞生物學(xué)、組織工程、生物醫(yī)學(xué)工程和藥物開發(fā)中的關(guān)鍵步驟。在傳統(tǒng)的體外細(xì)胞培養(yǎng)中,細(xì)胞多為貼壁和二維生長(zhǎng),由于離體后的細(xì)胞失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞之間的相互作用,而且處于相對(duì)靜止的環(huán)境中,所以細(xì)胞除了增殖外并沒有像在體內(nèi)那樣發(fā)揮其作用,也不能真實(shí)反映其在體內(nèi)的生存情況。微流控芯片和傳統(tǒng)的體外細(xì)胞培養(yǎng)相比,具有很多優(yōu)點(diǎn),諸如:精確控制物質(zhì)濃度、溶液溫度和pH值等細(xì)胞微環(huán)境要素;提供微小和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)來模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生存環(huán)境;提供三維生長(zhǎng)環(huán)境以模擬細(xì)胞在體內(nèi)的狀態(tài),考察細(xì)胞的行為(如基因表達(dá)、受體作用和其它生命活動(dòng))等。在哺乳動(dòng)物組織中,細(xì)胞的生長(zhǎng)受到多方面因素的影響,不僅細(xì)胞之間存在相互作用,細(xì)胞與胞外基質(zhì)也有密切聯(lián)系,同時(shí)細(xì)胞還受到各種自分泌、旁分泌及激素等信號(hào)分子的作用。因此建立細(xì)胞體外三維培養(yǎng)環(huán)境,需要將細(xì)胞植入模擬細(xì)胞外基質(zhì)的培養(yǎng)環(huán)境中。目前有天然和合成的水凝膠已被成功整合到芯片上,但與此同時(shí)也出現(xiàn)一些問題,如操作復(fù)雜和阻礙物質(zhì)的傳輸。為解決這些問題,Ong等設(shè)計(jì)了橢圓形微柱陣列的芯片(圖1A)。細(xì)胞預(yù)先用高碘酸鈉處理,使其表面的糖蛋白產(chǎn)生醛基,再與培養(yǎng)液中的聚乙烯亞胺酰肼(polyethyleneimine-hydrazide)連接物結(jié)合形成三維生長(zhǎng)結(jié)構(gòu),最后,用鈣黃綠素和碘化丙啶染色后,觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。另外,Huang等設(shè)計(jì)了一款自動(dòng)培養(yǎng)細(xì)胞的芯片(圖1B),通過設(shè)置氣動(dòng)微泵和微閥使培養(yǎng)液和緩沖液流入細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域,同時(shí)將代謝廢物排出。芯片中的柵欄形微型加熱器和溫度感應(yīng)器能提供一個(gè)較恒定的溫度(37?C±1?C)。羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液則為細(xì)胞生長(zhǎng)提供適宜的pH條件。Nevill等設(shè)計(jì)制備微流控芯片,將細(xì)胞培養(yǎng)和電化學(xué)裂解功能結(jié)合在一起,對(duì)細(xì)胞中的蛋白(p53和HRP)進(jìn)行分析,大大降低了分析時(shí)間和成本。在微流控芯片上還可以進(jìn)行肝、肺細(xì)胞和組織培養(yǎng),構(gòu)建體外毒理實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/span>。除此之外,微流控芯片還可以用于干細(xì)胞和癌細(xì)胞的培養(yǎng)。由于干細(xì)胞生活在復(fù)雜的物理、化學(xué)和生物因素下,傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法不能很好地模擬其生理環(huán)境,并受到各種限制,而微流控芯片技術(shù)可以更好地模擬干細(xì)胞在體內(nèi)復(fù)雜的生活環(huán)境,以高通量和可變方式精確控制各種參數(shù)。癌細(xì)胞最大的特點(diǎn)是侵襲和轉(zhuǎn)移,利用微流控芯片可以模擬癌細(xì)胞滲入血管、在血管內(nèi)隨血液循環(huán)流動(dòng)、滲出血管和遷移到靶組織等一系列過程。由此可見,采用微流控芯片來培養(yǎng)細(xì)胞將成為細(xì)胞生物學(xué)研究的一個(gè)重要手段。

A:非水凝膠3D微流控細(xì)胞培養(yǎng)體系包括兩個(gè)入口(一個(gè)是培養(yǎng)基入口,另一個(gè)是細(xì)胞灌注入口)和一個(gè)出口。微壩結(jié)構(gòu)將微流控通道分為中心細(xì)胞培養(yǎng)室和兩邊用來擴(kuò)散培養(yǎng)基的通道兩部分;B:細(xì)胞自動(dòng)培養(yǎng)體系圖解說明,此體系由一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室,四個(gè)微泵、四個(gè)微閥、微通道、儲(chǔ)液池、兩個(gè)加熱器和一個(gè)微型溫度傳感器組成。

2.細(xì)胞分選

細(xì)胞分選是從非均一細(xì)胞體系中篩選出性質(zhì)均一細(xì)胞的技術(shù),在細(xì)胞免疫學(xué)和臨床診斷中具有非常重要的作用。目前最常用的細(xì)胞分選方法有磁珠免疫法和流式細(xì)胞儀法,其中磁珠免疫法對(duì)細(xì)胞表面有特異性要求,而流式細(xì)胞儀雖然能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速可靠的分選,但其體積龐大、價(jià)格昂貴、難以滅菌。除此之外還需要專業(yè)人員操作和復(fù)雜的前處理過程,并伴隨大量的樣本消耗。為了彌補(bǔ)這些缺陷,有報(bào)道將流式細(xì)胞儀的主要部件與微流控芯片結(jié)合起來,從而實(shí)現(xiàn)小型化和低成本分選細(xì)胞。

目前,以微流控芯片技術(shù)為平臺(tái)的細(xì)胞分選方法主要有兩種:

(1) 以微結(jié)構(gòu)和層流為基礎(chǔ)的被動(dòng)分選;

(2)以各種外力(如磁力、介電電泳力、電動(dòng)力等)驅(qū)動(dòng)的主動(dòng)分選。

2.1以細(xì)胞大小為基礎(chǔ)的過濾分選

借助微型機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù),Chen等設(shè)計(jì)和制造的立柱型和堤壩型過濾芯片,依靠平行的微立柱和微壩尺寸大小來分離細(xì)胞。圖2A所示的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片利用紅細(xì)胞與白細(xì)胞體積大小的差異將紅細(xì)胞從大鼠全血中分離出來,在主通道的垂直方向設(shè)置了微型堤壩,兩者存在5?m的高度差,當(dāng)緩沖液沿垂直主通道方向灌流時(shí),紅細(xì)胞被沖到側(cè)面,經(jīng)過微型堤壩結(jié)構(gòu)流入收集池里。圖2B所示芯片在主通道內(nèi)兩側(cè)設(shè)計(jì)了兩排直徑20μm、間隔6.5μm的立柱,圓餅狀、體積較小的紅細(xì)胞能通過立柱間的縫隙進(jìn)入兩邊的通道,而圓球狀的體積較大的白細(xì)胞則留在主通道內(nèi),從而達(dá)到分選效果,與此同時(shí),連續(xù)流動(dòng)的溶液將白細(xì)胞沖到出口處,避免微通道發(fā)生堵塞。

2.2受介電電泳作用的細(xì)胞分選

介電電泳是指本身不帶電、但可以發(fā)生不同程度極化的顆粒在非均勻的電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象。與電泳分離不同,介電電泳不是依靠粒子的荷質(zhì)比,而是依據(jù)不同介電性質(zhì)對(duì)顆粒進(jìn)行分離。當(dāng)處于非均勻電場(chǎng)時(shí),細(xì)胞產(chǎn)生極化現(xiàn)象,其表面會(huì)發(fā)生偶極矩作用,進(jìn)而細(xì)胞在介電電泳力作用下,向高場(chǎng)強(qiáng)(正向介電電泳)或低場(chǎng)強(qiáng)(負(fù)向介電電泳)方向移動(dòng)。由于細(xì)胞的大小、形狀、介電性質(zhì)不同,細(xì)胞所受介電電泳力的大小和方向也不盡相同,因此可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選。

以微流控芯片介電電泳為基礎(chǔ)的分選技術(shù)具有很多優(yōu)點(diǎn):

(1) 所需技術(shù)成本低;

(2) 不需要對(duì)細(xì)胞表面進(jìn)行修飾;

(3) 操作簡(jiǎn)便;

(4) 特異性高等。

基于以上優(yōu)點(diǎn),在微流控芯片上進(jìn)行介電電泳已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分選。Nascimento等利用芯片介電電泳對(duì)受寄生蟲侵染和未被侵染的紅細(xì)胞進(jìn)行分選。當(dāng)紅細(xì)胞受到侵染后,其細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和表面抗原會(huì)發(fā)生變化,細(xì)胞膜通透性提高,使兩種細(xì)胞在電場(chǎng)中受力大小和方向不同,導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變,進(jìn)而獲得分離。為了在芯片上實(shí)現(xiàn)介電電泳必須產(chǎn)生非均勻電場(chǎng),如圖2C所示,X型的絕緣結(jié)構(gòu)用于產(chǎn)生非均勻電場(chǎng),通過改變電壓和液體流速,收集HeLa細(xì)胞。Pommer等在微流控芯片上設(shè)計(jì)了兩個(gè)非均勻電場(chǎng),對(duì)樣品中的細(xì)胞進(jìn)行串聯(lián)介電電泳分離,從全血樣品中獲得了純度為95%的血小板。

2.3光驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞分選

用光作用力進(jìn)行細(xì)胞分選主要有熒光激發(fā)和光鑷兩種形式。熒光激發(fā)的細(xì)胞分選是將目標(biāo)細(xì)胞預(yù)先進(jìn)行熒光標(biāo)記,經(jīng)過檢測(cè)區(qū)域時(shí)目標(biāo)細(xì)胞被識(shí)別,在激光束作用下使目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)入選擇通道。Wang等在微流控芯片上以熒光激發(fā)的方式,將被綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞分選出來,如圖2D所示,當(dāng)樣品流經(jīng)檢測(cè)區(qū)域時(shí),光電二極管檢測(cè)到細(xì)胞的存在,接著光電倍增管對(duì)細(xì)胞所發(fā)熒光進(jìn)行分析,聲光調(diào)制器觸發(fā)光學(xué)開關(guān)將表達(dá)綠色熒光的HeLa細(xì)胞送入收集通道。光鑷是一種光效應(yīng),激光聚集可形成光阱,微小物體受光壓而被束縛在光阱處,移動(dòng)光束使微小物體隨光阱移動(dòng),借此可在顯微鏡下對(duì)微小物體操控。如圖2E所示,在光鑷芯片上,細(xì)胞樣本被數(shù)字成像系統(tǒng)檢測(cè)、識(shí)別、追蹤,以產(chǎn)生的可控信號(hào)為基礎(chǔ),利用激光光鑷,目標(biāo)細(xì)胞自動(dòng)轉(zhuǎn)入鄰近的鞘流,最終被分流到下游收集區(qū)域。

2.4磁性細(xì)胞分選

磁性分選在芯片細(xì)胞分選中尤其受歡迎,因?yàn)榇帕?duì)細(xì)胞活力的影響最小。磁性細(xì)胞分選的原理是:在目標(biāo)細(xì)胞表面包裹磁性微粒[38]或?qū)⒋判约{米顆粒引入細(xì)胞內(nèi)部,從而使其帶上磁性標(biāo)簽,當(dāng)帶有磁性標(biāo)簽的細(xì)胞流經(jīng)磁場(chǎng)區(qū)域時(shí),磁力使目的細(xì)胞偏離原來的運(yùn)動(dòng)軌道。由于不同細(xì)胞的大小、磁化率、流速不同,細(xì)胞偏離原來層流方向的程度不同,從而將細(xì)胞分選出來。微流控芯片上的磁性細(xì)胞分選可以實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種及多種細(xì)胞的分選,可以將待分選的細(xì)胞用磁性標(biāo)簽標(biāo)記,其余細(xì)胞不做標(biāo)記,當(dāng)目標(biāo)細(xì)胞流經(jīng)磁場(chǎng)區(qū)域時(shí)運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變,從而被分離出來;也可以將多種細(xì)胞施加不同磁性標(biāo)簽以達(dá)到分選目的。Adams等就在微流控芯片連續(xù)層流基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)多種細(xì)胞進(jìn)行空間定位分選,如圖2F所示,細(xì)胞在進(jìn)樣之前用不同磁性標(biāo)簽標(biāo)記,流經(jīng)磁場(chǎng)區(qū)域時(shí),不同細(xì)胞在磁力和流體驅(qū)動(dòng)力的合力作用下流向不同的收集通道,最后在收集通道將細(xì)胞用洗脫液洗脫出來,從而達(dá)到細(xì)胞分選的目的。

A:用于分選血細(xì)胞的PMMA微流控芯片。左圖為微流控芯片整體示意圖,共有7個(gè)口,1:注血口;2-4:緩沖液注入口;5,6:紅細(xì)胞收集口;7:廢液口。右圖為分選區(qū)域局部放大圖;B:用于分選細(xì)胞的連續(xù)流動(dòng)微流控芯片。左圖為立柱型分選血細(xì)胞芯片概略圖,a:血液樣品注入口,b:白細(xì)胞收集口;c:紅細(xì)胞和血漿收集口;右圖為裝置末端微立柱陣列掃描電鏡圖;C:負(fù)向介電電泳分離HeLa細(xì)胞的微流控芯片;D:熒光激發(fā)的微流控芯片細(xì)胞分選示意圖,細(xì)胞流經(jīng)中心通道時(shí),經(jīng)過分析轉(zhuǎn)換,靶細(xì)胞流向收集口,而其他細(xì)胞流入廢液口;E:自動(dòng)化細(xì)胞分選系統(tǒng)設(shè)計(jì)圖。當(dāng)細(xì)胞通過興趣區(qū)時(shí),數(shù)字圖像處理系統(tǒng)產(chǎn)生信號(hào),激發(fā)激光光鑷,將目的細(xì)胞從樣品中分離出來;F:多靶標(biāo)磁性細(xì)胞分選結(jié)構(gòu)。樣品中含有過量的非目標(biāo)細(xì)胞和2個(gè)不同的靶細(xì)胞(目標(biāo)1和目標(biāo)2),靶細(xì)胞分別用特定標(biāo)簽(標(biāo)簽1和標(biāo)簽2)標(biāo)記,細(xì)胞在MFS1和MFS2產(chǎn)生高梯度磁場(chǎng)區(qū)域發(fā)生分離

微流控芯片技術(shù)自20世紀(jì)90年代出現(xiàn)以后,隨著生物、材料、化學(xué)、物理工程和電子工程等學(xué)科的介入,目前已取得了巨大的發(fā)展,其最終目的是建立多功能芯片實(shí)驗(yàn)室。微流控芯片技術(shù)正以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)越來越多地應(yīng)用到細(xì)胞生物學(xué)研究中,其不僅可以為細(xì)胞提供可控制的生存微環(huán)境,與其他分析方法結(jié)合檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)生化過程,而且在細(xì)胞個(gè)體、細(xì)胞群體和多細(xì)胞生命體三個(gè)層次對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)進(jìn)行深入研究。另一方面,微流控芯片仍處于發(fā)展初期,許多方面的技術(shù)還不成熟,如不能進(jìn)行長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng);細(xì)胞三維培養(yǎng)中一些水凝膠和粘連蛋白的引入可能阻塞通道和妨礙物質(zhì)傳輸;電裂解細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生的焦耳熱和氣泡會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝等。目前微流控芯片大多處于實(shí)驗(yàn)室概念化論證階段,尚未達(dá)到理想的商業(yè)化和通用化程度;對(duì)微流控芯片技術(shù)了解不多的生物研究人員,應(yīng)用起來還有一定的困難。但是,基于微流控芯片的突出優(yōu)點(diǎn)和人們對(duì)新技術(shù)的需求,我們相信微流控芯片細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室將成為細(xì)胞生物學(xué)研究的重要平臺(tái)。

（文章節(jié)選自：微流控芯片技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展 作者：姚　琳　白亮　吳亮其　丁永勝* 科學(xué)網(wǎng)科學(xué)網(wǎng)轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）