本文將微流體技術(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合,介紹了一種基于微系統(tǒng)平臺(tái)控制細(xì)胞分布進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方法,該微系統(tǒng)芯片不需要借助于凝膠等介質(zhì)以及對(duì)微流體流速的精確控制,只利用微通道之間的狹縫,能夠有效的控制細(xì)胞的分布區(qū)域,實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)區(qū)域的相對(duì)獨(dú)立,而小分子的培養(yǎng)基和藥物成分可以自由流動(dòng)通過(guò),實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)。同時(shí)在該平臺(tái)上可以對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè),為藥物篩選等提供了一個(gè)全新的細(xì)胞培養(yǎng)和篩選平臺(tái)。

1實(shí)驗(yàn)方法

1.1 芯片制作

本實(shí)驗(yàn)中制作如圖1(a)所示的細(xì)胞培養(yǎng)微芯片,其中b孔為細(xì)胞懸濁液進(jìn)樣孔,細(xì)胞培養(yǎng)通道的寬度為100μm,a孔和c孔為培養(yǎng)基或者刺激液進(jìn)樣孔,其管道寬度為200μm,該芯片的主要特點(diǎn)是如圖1(b)所示的粗黑線處的通道高度僅為5μm的狹縫,該狹縫既可保證細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)與微管道區(qū)的連通,又可以使這兩個(gè)區(qū)域相對(duì)獨(dú)立,保證細(xì)胞在固定的區(qū)域生長(zhǎng),而培養(yǎng)基和刺激液等小分子可以自由流通。該細(xì)胞培養(yǎng)微芯片制作的基本方法是先通過(guò)微加工技術(shù)在硅片表面制作出雙層的SU-8負(fù)性光刻膠模具,然后通過(guò)模塑方法形成具有微結(jié)構(gòu)的PDMS基片,最后與玻璃鍵合形成封閉的通道網(wǎng)絡(luò),用于細(xì)胞的培養(yǎng)和研究,其制作的工藝流程圖如圖2所示。芯片制作的關(guān)鍵工藝是通過(guò)制作雙層的SU-8負(fù)性光刻膠模具形成狹縫,下面詳細(xì)介紹芯片制作的工藝過(guò)程。

圖1芯片的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1Schematicmapofthechip(a)Structuresofthechip;(b)diagramofthecross-sectionalviewofthemicrochannel

圖2芯片制作流程示意圖Fig.2Schematicillustrationofproceduretofabricatethechip

首先是利用SU-8負(fù)性光刻膠進(jìn)行“多次光刻、一次顯影”[12]工藝制作雙層的細(xì)胞芯片模具。將硅片在Piranha洗液(硫酸和雙氧水按5:1混合)中煮沸10min,冷卻后用去離子水沖洗干凈,氮?dú)獯蹈珊笤?00oC烘箱中烘30min。在清洗干凈并烘干的硅片上甩涂稀釋的負(fù)性光刻膠SU8-2025(MicroChemCorp.,MA,USA),放在熱板上在65oC烘1min然后升溫至95oC保持2min,緩慢降溫至室溫。在光刻機(jī)中將第一層掩模版與硅片對(duì)準(zhǔn),曝光,然后對(duì)基片進(jìn)行PEB(Postexposedbake,PEB),即在熱板上65oC烘1min然后升溫到95oC保持1min,緩慢降溫至室溫,這樣就將第一層的圖形轉(zhuǎn)移到SU-8光刻膠上。再將第二層SU8-2025甩涂于基片表面,在熱板上加熱到65oC保持1min然后加熱到95oC保持3min冷卻至室溫完成前烘,對(duì)準(zhǔn)第二層掩模曝光,將硅片放到熱板上加熱到65oC保持1min然后升溫至95oC保持3min完成PEB,緩慢冷卻至室溫,最后超聲輔助顯影,形成雙層的SU-8模具。

將PDMS(DowCorning,Michigan,USA)單體與固化劑按照10:1的比例混合均勻后,抽真空后進(jìn)行脫氣處理,澆注在有SU-8微結(jié)構(gòu)的硅片上,放置在80oC的熱板上固化1h,冷卻后從硅片表面剝離,打孔,并切割成合適的大小備用。

將制備好的具有微結(jié)構(gòu)的PDMS和清洗干凈的玻璃片或無(wú)結(jié)構(gòu)的PDMS基片放入氧離子表面處理機(jī)中對(duì)其表面處理15s,取出后將二者迅速貼合,形成封閉的微通道網(wǎng)絡(luò),完成細(xì)胞培養(yǎng)微芯片的制作。

1.2 微芯片內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)

注入芯片內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)的3T3細(xì)胞和B-Cap細(xì)胞(上海市第九人民醫(yī)院組織工程中心)。細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM(Gibco),加入10%的胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)和100μL/mL的鏈青霉素(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司,杭州),消化液為0.25%的胰酶和0.02%的EDTA(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司,杭州)。

將制作好的細(xì)胞培養(yǎng)微芯片用75%的酒精浸潤(rùn),然后放入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)皿(PolystyrenePetridish)中,用紫外線照射1h,進(jìn)行消毒。為利于細(xì)胞在微通道內(nèi)貼壁生長(zhǎng),在微通道內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)液浸潤(rùn)過(guò)夜,使芯片表面包被蛋白。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行消化,吹散打勻,通過(guò)進(jìn)液孔導(dǎo)入芯片內(nèi),放入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中每隔一天更換芯片內(nèi)部的培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱外培養(yǎng)時(shí),將導(dǎo)入細(xì)胞的芯片放在ITO玻璃加熱平臺(tái)上,同時(shí)在培養(yǎng)基內(nèi)添加與DMEM等量的Leibovitz’sL-15(Gibco)以保證細(xì)胞外基質(zhì)的酸堿度穩(wěn)定[13],并且每12h補(bǔ)充一次培養(yǎng)液,以保證培養(yǎng)基的穩(wěn)定。

1.3 細(xì)胞活性檢測(cè)

芯片內(nèi)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞活性通過(guò)Live/deadviability/cytotoxicitykit試劑盒(Molecularprobes)進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞在芯片內(nèi)生長(zhǎng)72h后,先通入PBS清洗5min,再通入含2μmol/LCalceinAM和4μmol/LEthidiumhomodier-1(EthD-1)的混合液在室溫下孵育30min,然后立即在熒光顯微鏡(Olympus)下觀察并拍照。

2結(jié)果與討論

2.1材料選擇

制作細(xì)胞芯片的材料可以是硅、玻璃、PDMS等生物兼容性材料。硅材料雖然具有良好的微加工性能,但是由于透光性不好,不便于觀察細(xì)胞的形態(tài),因此硅材料多用于刻蝕或者是在其表面用負(fù)膠加工制作模具,用于模塑的方法形成細(xì)胞培養(yǎng)芯片。玻璃不僅具有良好的微加工性能,還具有很好的透光性和生物兼容性,被廣泛的用于細(xì)胞芯片的制作,但是由于其不透氣性,因此采用全玻璃材料制作細(xì)胞芯片時(shí)需要在培養(yǎng)液中溶入足夠的氧氣,并且頻繁更換培養(yǎng)液或者是采用灌流的方法才能保證細(xì)胞的生長(zhǎng)。PDMS是目前微加工技術(shù)中廣泛應(yīng)用的一種材料,由于其可以通過(guò)模具批量加工,生產(chǎn)成本低,且PDMS具有很好的透光性、生物兼容性和透氣性[14],是制作細(xì)胞培養(yǎng)微芯片的優(yōu)良材料。

本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)PDMS與玻璃鍵合制作細(xì)胞培養(yǎng)微芯片,既有良好的生物兼容性,又便于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的觀察,還因?yàn)椴牧蟽?yōu)良的透氣性特點(diǎn),可以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)氣體氛圍的要求,更有利于細(xì)胞的在片培養(yǎng)和實(shí)時(shí)觀測(cè)。

2.2SU-8雙層模具的制作

目前,基于SU-8負(fù)性光刻膠加工模具的技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞培養(yǎng)微芯片的模具是將雙層結(jié)構(gòu)做到一片硅片上,采用“兩次曝光,一次顯影”方法制作的SU-8負(fù)性光刻膠模具,可以簡(jiǎn)化模具的制作工藝流程,避免模塑成型后繁瑣的結(jié)構(gòu)對(duì)準(zhǔn)步驟進(jìn)行鍵合,提高芯片的制作效率和成品率。

2.3可變式的芯片結(jié)構(gòu)

將進(jìn)樣孔打在有微結(jié)構(gòu)的基片上和在沒有微結(jié)構(gòu)的基片上,芯片內(nèi)的微縫的位置會(huì)不同。如圖3(a)所示,若將液體進(jìn)樣孔開在具有微結(jié)構(gòu)圖形的基片上,然后與沒有微結(jié)構(gòu)的基片鍵合,則微縫在芯片底部;如圖3(b)所示,若將液體進(jìn)樣孔開在沒有微結(jié)構(gòu)圖形的基片上,然后與具有微結(jié)構(gòu)的基片鍵合,則微縫在芯片的頂部。這樣通過(guò)一個(gè)模具基片可以制作出兩種特點(diǎn)不同的細(xì)胞培養(yǎng)微芯片,可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要選擇適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)。當(dāng)微縫在芯片底部時(shí),可以保證液體流動(dòng)區(qū)的液體對(duì)細(xì)胞的直接刺激;當(dāng)微縫在芯片頂部的時(shí)候,可以有效地隔離液體流動(dòng)區(qū)對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)細(xì)胞產(chǎn)生的剪切力等的影響,通過(guò)微流體的擴(kuò)散作用對(duì)細(xì)胞提供養(yǎng)分和進(jìn)行研究。最后制成的芯片如圖4(a)所示,4(b)和4(c)為管道微結(jié)構(gòu)的顯微鏡的圖片,可以清楚地看到中間的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域和兩側(cè)的微流體區(qū)域有微小的狹縫相通。

圖3兩種芯片結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3Schematicmapsoftwodifferentchips

圖4芯片圖Fig.4Viewsofthechip(a)themicrodevices;(b)structureofthemicrochannel;(c)cross-sectionalviewofthemicrochannel

2.4細(xì)胞的固定、在片培養(yǎng)與檢測(cè)

為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在固定區(qū)域的培養(yǎng),芯片內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域與周圍的微通道區(qū)域之間連通的狹縫的高度為5μm,而細(xì)胞的直徑約為10~20μm,因此,細(xì)胞懸濁液從細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)的進(jìn)樣孔導(dǎo)入芯片后,通過(guò)狹縫的攔截及微流體的流動(dòng)使細(xì)胞只分布在細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域,有效的控制細(xì)胞的分布區(qū)域。圖5(a)為3T3細(xì)胞剛導(dǎo)入后芯片內(nèi)在微縫處的分布圖,可見狹縫對(duì)細(xì)胞有很好的攔截作用;圖5(b)為3T3細(xì)胞在培養(yǎng)區(qū)域內(nèi)貼壁生長(zhǎng)的狀態(tài),說(shuō)明細(xì)胞在該芯片內(nèi)生長(zhǎng)狀態(tài)良好。圖5(c)和5(d)為細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒對(duì)72h后芯片內(nèi)同一區(qū)域內(nèi)的B-Cap細(xì)胞進(jìn)行熒光染色的照片,由于calceinAM親脂性很高,能夠穿透細(xì)胞膜脫去AM基,使活細(xì)胞發(fā)出綠色熒光(如圖5(c)所示),而EthD-1不能穿透細(xì)胞膜,因此只能使死細(xì)胞激發(fā)紅色熒光(如圖5(d)所示)。芯片內(nèi)絕大部分細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光,只有很少量紅色細(xì)胞,表明細(xì)胞在該芯片內(nèi)有很高的成活率,適宜進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)。

圖5細(xì)胞在芯片內(nèi)的圖片F(xiàn)ig.5Cellsinthechip(a)cellslaybesidesthedamafterinfused;(b)cellsgrowthinthechip;(c)stainingwithCalceinAM;(d)stainingwithEthD-1

2.5培養(yǎng)箱外細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)時(shí)觀測(cè)

細(xì)胞狀態(tài)的實(shí)時(shí)觀測(cè)是細(xì)胞研究的需要。脫離了培養(yǎng)箱的培養(yǎng),由于無(wú)法滿足溫度以及酸堿度的條件,因此調(diào)整這些因素以保證細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)。因此,實(shí)驗(yàn)中通過(guò)添加Leibovitz’sL-15以保證細(xì)胞外基質(zhì)的酸堿度穩(wěn)定;利用實(shí)驗(yàn)室自制的ITO玻璃加熱平臺(tái)上進(jìn)行培養(yǎng)[15],保證細(xì)胞生活所需要的溫度條件;以及每12h補(bǔ)充一次培養(yǎng)液或灌流的方法,保證培養(yǎng)基的穩(wěn)定。通過(guò)以上三個(gè)條件的優(yōu)化,該微芯片成功的應(yīng)用于培養(yǎng)箱外細(xì)胞培養(yǎng),圖6為3T3細(xì)胞在箱外培養(yǎng)2d的圖片,細(xì)胞仍保持良好狀態(tài)。

圖63T3細(xì)胞在培養(yǎng)箱外培養(yǎng)2d的照片F(xiàn)ig.63T3cellsculturedoutsidetheincubatorafter2days

3小結(jié)

采用“兩次光刻,一次顯影”技術(shù)制作SU-8負(fù)性光刻膠模具,澆注PDMS,固化成形和鍵合工藝制作的具有狹縫的微系統(tǒng)芯片,能夠有效控制細(xì)胞在芯片內(nèi)的分布,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在微芯片內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng),并且可以根據(jù)狹縫的位置不同設(shè)計(jì)不同的芯片結(jié)構(gòu),滿足多種實(shí)驗(yàn)要求。同時(shí)該芯片可在培養(yǎng)箱外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),能夠保持細(xì)胞的活性,進(jìn)行細(xì)胞狀態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。該芯片將微流體技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)有機(jī)結(jié)合,為基于微系統(tǒng)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞研究提供了一種新的研究平臺(tái)。

文獻(xiàn)來(lái)源生物工程學(xué)報(bào) 作者：邵建波，吳蕾，金慶輝，趙建龍

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