卵母細(xì)胞的低溫保存是輔助生殖領(lǐng)域的重要方法，也為優(yōu)質(zhì)家畜和瀕危野生動(dòng)物保種提供新途徑。卵母細(xì)胞有著復(fù)雜的細(xì)胞器和超微結(jié)構(gòu)，它們對(duì)外界環(huán)境的改變非常敏感，臨床上所得到的冷凍卵母細(xì)胞的復(fù)蘇率、受精率、胚胎率及分娩率還不高。

目前，常用的卵母細(xì)胞低溫保存技術(shù)是玻璃化保存。它是采用多步法將卵母細(xì)胞加入到高濃度的低溫保護(hù)劑中，然后通過(guò)冷凍載體，如開放式拉長(zhǎng)麥管(openpulledstraw，OPS)、石英毛細(xì)管(quartzcapillary，QC)及Cryotop法等投入液氮中，以超快的冷卻速度完成玻璃化，復(fù)溫時(shí)再采用多步法洗脫保護(hù)劑。傳統(tǒng)的分步添加-去除保護(hù)劑的方法使細(xì)胞在不同濃度的溶液間轉(zhuǎn)移，細(xì)胞外溶液滲透壓發(fā)生階梯狀突變，卵母細(xì)胞將受到較大的滲透損傷。近年來(lái)，有學(xué)者提出運(yùn)用微流控技術(shù)來(lái)進(jìn)行低溫保護(hù)劑的添加和去除，使細(xì)胞外的保護(hù)劑濃度呈連續(xù)性變化，減少對(duì)細(xì)胞的滲透損傷和毒性損傷。Song等成功制作了水平三流的微流控裝置，用于添加和去除肝癌細(xì)胞的保護(hù)劑3mol/L丙二醇，結(jié)果證明經(jīng)微流控技術(shù)處理后的細(xì)胞存活率比一步法高25%，比兩步法高10%。楊云等制作了用于豬卵母細(xì)胞保護(hù)劑線性添加的微流體裝置，結(jié)果表明，微流控芯片連續(xù)添加保護(hù)劑所得細(xì)胞存活率及卵裂率(92.8%，75.8%)均顯著高于一步法(59.8%，36.6%)及兩步法(76.5%，51.6%)。微流控連續(xù)法有很多種變化線型，衣星越等進(jìn)一步優(yōu)化了微流控連續(xù)添加并去除保護(hù)劑的線型，設(shè)計(jì)了凸型、凹型以及直線型的添加去除方式，組合出9種聯(lián)用方案用于卵母細(xì)胞保護(hù)劑的添加和去除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)凹形添加-凸型去除聯(lián)用方案所得卵母細(xì)胞存活率與囊胚率與新鮮組差異最小。但是以上研究?jī)H優(yōu)化了保護(hù)劑添加和去除的過(guò)程，并未將卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍，離卵母細(xì)胞低溫保存的臨床應(yīng)用還有一定的差距。

此外，有研究者提出將細(xì)胞在微流控芯片中進(jìn)行低溫保存的一體化操作。Kondo等在微流控芯片上培養(yǎng)HeLa、NIH3T3及MCF-7細(xì)胞，并將裝有細(xì)胞的微流控芯片和對(duì)照組培養(yǎng)皿在-80℃下冷凍保存，結(jié)果表明低溫保存后微流控裝置內(nèi)的細(xì)胞存活率顯著高于對(duì)照組。Li等運(yùn)用聚二甲基硅氧烷(PDMS)及玻璃制作了PDMS-玻璃可控溫微流控芯片，對(duì)酵母菌細(xì)胞進(jìn)行低溫保存，酵母菌細(xì)胞在有溫控芯片內(nèi)的存活率(74%)顯著高于無(wú)溫控芯片(27%)，但與傳統(tǒng)保存方法所得存活率無(wú)顯著差異。Zou等將未添加保護(hù)劑的精子置于微流控芯片投入液氮保存，冷凍后的精子存活率與發(fā)育能力與對(duì)照組無(wú)顯著差異。對(duì)于卵母細(xì)胞的冷凍保存，如果將保護(hù)劑添加、冷凍保存、復(fù)溫、保護(hù)劑去除整合在一個(gè)微流控芯片上，將大大簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，防止轉(zhuǎn)移過(guò)程中的細(xì)胞丟失和對(duì)細(xì)胞造成額外的機(jī)械損傷。目前關(guān)于這方面的研究還未見報(bào)道。

針對(duì)以上問(wèn)題，本文首先將傳統(tǒng)分步添加-去除保護(hù)劑法和微流控凸型添加-凹型去除方案分別與3種冷凍載體及方法(OPS法、QC法、Cryotop法)搭配使用，對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證微流控芯片添加保護(hù)劑-冷凍載體冷凍-微流控芯片去除保護(hù)劑這一整套方案的有效性；然后選擇傳熱性能較好的透明陶瓷和玻璃制作一體化芯片，將卵母細(xì)胞在一體化芯片上進(jìn)行添加-冷凍-去除實(shí)驗(yàn)，以冷凍保存后的細(xì)胞存活率和發(fā)育率為判斷依據(jù)，篩選出較好的方案；最后對(duì)冷凍后卵母細(xì)胞的早期凋亡情況、胞內(nèi)活性氧水平和線粒體膜電位水平進(jìn)行分析，考察其冷凍后的質(zhì)量。本研究是微流控芯片用于卵母細(xì)胞低溫保存的全新嘗試，提出了卵母細(xì)胞低溫保存的新思路，在臨床方面將有較好的應(yīng)用前景。

1材料與方法

1.1主要試劑和溶液

組織培養(yǎng)液(TCM199)、二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)、蔗糖、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司(美國(guó))。本實(shí)驗(yàn)中所用其他試劑未特殊說(shuō)明均購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))。

本實(shí)驗(yàn)中用到的溶液溫度均為37℃，濃度為體積比濃度。培養(yǎng)液：TCM199+10%豬卵泡液+10%FBS+激素；低溫保護(hù)劑1：TCM199+7.5%EG+7.5%DMSO+20%FBS；低溫保護(hù)劑2:TCM199+15%EG+15%DMSO+20%FBS+0.4mol/L蔗糖；去除溶液1：TCM199+20%FBS+0.3mol/L蔗糖；去除溶液2:TCM199+20%FBS+0.15mol/L蔗糖。

用于檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡水平、胞內(nèi)活性氧水平以及線粒體膜電位水平的試劑盒均購(gòu)自中國(guó)碧云天生物科技有限公司。

1.2豬卵母細(xì)胞的采集和體外成熟培養(yǎng)

自上海市嘉定區(qū)某屠宰場(chǎng)采集新鮮的豬卵巢，放置于37℃含有500U青鏈霉素的生理鹽水中，在1h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用帶有18G針頭的5ml注射器在卵巢表面吸取直徑為2～6mm卵泡的卵泡液后注入15ml的離心管中，靜置沉淀后，在體視顯微鏡下拾取胞質(zhì)均勻且表面包被3層或以上的致密卵丘細(xì)胞的卵丘卵母復(fù)合體(COCs)。洗滌后將細(xì)胞移入四孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，每孔含500滋l培養(yǎng)液，并覆上滅菌礦物油。放入(39依0.5)℃、95%空氣、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)42～46h后，得到M域期卵母細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)前，用0.1%透明質(zhì)酸酶反復(fù)吹打以去除卵丘細(xì)胞，后用TMC199洗滌3～5次，備用。

1.3微流控芯片的制作及微混合系統(tǒng)的搭建

用于低溫保護(hù)劑添加和去除的微流控芯片主要由Y型流體入口通道、蛇形溶液混合通道、細(xì)胞進(jìn)出通道及細(xì)胞分析腔組成。微通道橫截面的尺寸為寬100微米伊高100微米，Y型流體入口通道每條長(zhǎng)為10mm，蛇形混合通道每條長(zhǎng)為17mm，微通道總長(zhǎng)約135mm。細(xì)胞分析腔的尺寸為長(zhǎng)2000微米伊寬1000微米伊高150微米，為防止細(xì)胞在保護(hù)劑添加和去除過(guò)程中被溶液沖走，在操作腔的左右兩側(cè)各設(shè)一排柱狀障礙物，其直徑為100微米，兩障礙物間隔為50微米。

運(yùn)用模塑法制作微流控芯片。首先運(yùn)用AutoCAD2007設(shè)計(jì)通道后打印光刻掩膜，對(duì)掩膜進(jìn)行清洗、涂膠、前烘、曝光、顯影、堅(jiān)膜，得到光刻掩膜，在模具上固化處理好的PDMS預(yù)聚體，得到帶有微通道及細(xì)胞腔的PDMS基片層，將PDMS基片與PDMS蓋片用等離子氧化處理后直接貼合，進(jìn)行不可逆封接，在60℃～75℃的恒溫干燥箱中加固1h，得到PDMS微流控芯片，最后使用0.6mm打孔器制作芯片進(jìn)出口。

用于冷凍的芯片采用透明陶瓷及玻璃作為蓋片，與帶有通道的PDMS基片進(jìn)行不可逆封接，制作一體化PDMS-透明陶瓷以及PDMS-玻璃芯片。所用透明陶瓷為氧化鋁透明陶瓷，傳熱性能較好(傳熱系數(shù)為46W/m窯K)，厚度為200微米。所用玻璃為傳熱性能較好(傳熱系數(shù)為0.7～1.1W/m窯K)的玻璃，但若同樣選用200微米的玻璃，在與透明陶瓷組相同的降溫及升溫條件下容易斷裂，因此選用1mm厚的玻璃進(jìn)行芯片制作。

微流控添加-去除低溫保護(hù)劑的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)如圖1所示，由微注射泵/微量進(jìn)樣針/微流控芯片及體視顯微鏡組成。其中微流注射泵為雙通道注射/回吸可編程注射泵。通過(guò)注射泵調(diào)節(jié)單位時(shí)間內(nèi)緩沖溶液和低溫保護(hù)劑的流量來(lái)調(diào)節(jié)混合溶液的濃度變化。

Fig.1Aschematicillustrationofthemicrofluidicexperimentalsystem1:Microinjectionpump;2:Micro-syringe;3:Y-microfluidicchip;4:Stereoscopicmicroscope;5:Oocytechannel.

1.4冷凍載體

所用OPS管參照Vajta等的制作方法，細(xì)管的內(nèi)徑約為800～1000微米，壁厚約80微米。所購(gòu)QC毛細(xì)管(WH-MXG-530690，蘇州汶顥微流控技術(shù)股份有限公司)制作材料為人工合成的高純度石英玻璃，其內(nèi)徑為530微米，壁厚160微米。所購(gòu)Cryotop，塑料薄片長(zhǎng)20mm，寬0.4mm，厚0.1mm。

上述冷凍載體及用于冷凍的一體化芯片實(shí)物如圖2所示。

Fig.2Cryopreservationdevicesandintegrationmicrofluidicchips(a)OPS.(b)QC.(c)Cryotop.(d)PDMS-transparentceramicintegrationmicrofluidicchip.(e)PDMS-glassintegrationmicrofluidicchip

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1傳統(tǒng)冷凍與微流控冷凍保存方案的對(duì)比

傳統(tǒng)冷凍實(shí)驗(yàn)分3組，每組10枚已去除卵丘細(xì)胞的M域期卵母細(xì)胞。3組細(xì)胞分別在低溫保護(hù)劑1中平衡3～5min，移入低溫保護(hù)劑2中平衡30s，加載至OPS細(xì)管、QC毛細(xì)管及Cryotop塑料薄片，隨后直接投入液氮冷凍保存。2w后將3組細(xì)胞分批次取出，含有細(xì)胞的一端迅速插入去除溶液1中，待細(xì)胞解凍后平衡5min，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至去除溶液2中平衡5min，后取出用TCM199洗滌2～3次，放入含有10%FBS的TCM199溶液中靜置1h后進(jìn)行后續(xù)處理。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～5次。

微流控冷凍實(shí)驗(yàn)步驟如圖3a所示。實(shí)驗(yàn)分3組，每組10枚已去除卵丘細(xì)胞的M域期卵母細(xì)胞，分別利用細(xì)胞口吸器放入PDMS-PDMS芯片的操作腔中，兩微量進(jìn)液針內(nèi)分別為低溫保護(hù)劑2和基礎(chǔ)液TCM199。根據(jù)衣星越等對(duì)微流控連續(xù)添加保護(hù)劑的線型優(yōu)化結(jié)果，采用凹型添加法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行低溫保護(hù)劑的添加，裝有低溫保護(hù)劑2的進(jìn)液針的流速變化如圖4所示，微通道內(nèi)總流速為5滋l/min，總添加時(shí)間為10min。完成保護(hù)劑的添加后，用細(xì)胞口吸器將細(xì)胞吸出，迅速加載至OPS細(xì)管、QC毛細(xì)管及Cryotop塑料薄片，投入液氮進(jìn)行冷凍保存。2w后將3組細(xì)胞分批次取出，含有細(xì)胞的一端放入去除溶液1中進(jìn)行復(fù)溫，細(xì)胞解凍后，運(yùn)用口吸器吹入細(xì)胞分析腔對(duì)3組細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)劑去除，采用凸型去除法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)劑的去除。兩微量進(jìn)液針中分別為1mol/L的蔗糖溶液和基礎(chǔ)液TCM199，蔗糖溶液的流速變化如圖4所示，微通道內(nèi)總流速為5滋l/min，總?cè)コ龝r(shí)間為8min。保護(hù)劑去除完成后將細(xì)胞吸出轉(zhuǎn)移至含有10%FBS的TCM199溶液中靜置1h后進(jìn)行后續(xù)處理。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～5次。

1.5.2卵母細(xì)胞一體化芯片冷凍-解凍方案

一體化芯片實(shí)驗(yàn)步驟如圖3b所示。一次取6～7枚已去除卵丘細(xì)胞的M域期卵母細(xì)胞，分別利用細(xì)胞口吸器放入PDMS-透明陶瓷以及PDMS玻璃芯片的操作腔中，兩微量進(jìn)液針內(nèi)分別為低溫保護(hù)劑2和基礎(chǔ)液TCM199。然后采用與實(shí)驗(yàn)1.5.1中微流控組相同的凹型添加法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行低溫保護(hù)劑的添加。完成添加后將芯片直接投入液氮進(jìn)行冷凍保存2w后進(jìn)行解凍處理。將芯片取出放入38.5℃的恒溫水浴中解凍，導(dǎo)管出口始終保持朝上，以防止液體由導(dǎo)管進(jìn)入芯片，平衡至芯片表面沒(méi)有白霜。后選用與實(shí)驗(yàn)1.5.1中微流控組相同的凸型去除法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)劑的去除。完成保護(hù)劑的去除后將細(xì)胞吸出轉(zhuǎn)移至含有10%FBS的TCM199溶液中靜置1h后進(jìn)行后續(xù)處理。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

Fig.3Schematicofexperiments(a)MicrofluidicCPAaddition-removalprotocoliscombinedwiththreekindsofcryopreservationdevices.(b)Integrationmicrofluidicchipisemployedforoocytesloading,unloading,andcryopreservation.

Fig.4Theflowvelocityoftheconcaveadditionwithconvexremovalcombinationprotocol

1.6卵母細(xì)胞存活率及發(fā)育率判斷

采用二乙酸熒光素(FDA)對(duì)冷凍復(fù)溫后的卵母細(xì)胞進(jìn)行存活率檢測(cè)，卵母細(xì)胞用TCM199洗滌3次后轉(zhuǎn)入FDA中避光染色5～10min，再用TCM199洗滌3～5次，在倒置熒光鏡(1XY71，OLYMPUS，日本)下觀察染色情況，胞質(zhì)發(fā)強(qiáng)熒光視為活卵，無(wú)熒光或熒光較弱為死卵。采用電激活方法對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活，使用電融合儀(Sandiego，美國(guó))電激活卵母細(xì)胞后轉(zhuǎn)至胚胎培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，2d后觀察卵裂率。

1.7卵母細(xì)胞凋亡情況評(píng)價(jià)

采用Annexin吁-FITC以及PI試劑盒對(duì)冷凍復(fù)溫后的卵母細(xì)胞進(jìn)行早期凋亡水平檢測(cè)。按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞染色，染色后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞著色情況(Annexin吁-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光)：正常細(xì)胞不被Annexin吁-FITC以及PI染色；凋亡早期細(xì)胞僅被Annexin吁-FITC染色，而不被PI染色；壞死或凋亡晚期細(xì)胞將同時(shí)被Annexin吁-FITC以及PI染色。統(tǒng)計(jì)早期凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)后，以早期凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)與總細(xì)胞個(gè)數(shù)的比值作為實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞早期凋亡率。

細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生于氧化還原的中間步驟，其作用于細(xì)胞時(shí)，將引起胞內(nèi)鈣離子濃度升高、能量缺失以及脂質(zhì)氧化等[18]。有研究表明，冷凍保存過(guò)程中，胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧會(huì)引起氧化應(yīng)激、胞內(nèi)基本分子退化、細(xì)胞膜的脂質(zhì)氧化，從而造成卵母細(xì)胞以及胚胎的凋亡甚至死亡。采用含有熒光探針2憶,7憶-二氯熒光素二乙酸酯(2,7-dichlorofluoresceindiacetate，DCFH-DA)的活性氧檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活性氧水平檢測(cè)。染色后在熒光顯微鏡下觀察，DCFH-DA自身沒(méi)有熒光，其穿過(guò)細(xì)胞膜后，在胞內(nèi)水解生成DCFH，DCFH被胞內(nèi)活性氧氧化為有熒光的二氯熒光素(dichlorofluorescein，DCF)，通過(guò)記錄DCF的熒光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)胞內(nèi)活性氧水平，結(jié)果用平均熒光值表示。

線粒體在細(xì)胞中不僅僅是產(chǎn)生ATP的工具，在卵母細(xì)胞及胚胎的發(fā)育過(guò)程中也起著重要的作用。研究表明，在細(xì)胞的冷凍保存過(guò)程中，胞內(nèi)的線粒體分布以及線粒體膜功能會(huì)發(fā)生變化，使得細(xì)胞在凍后的發(fā)育能力降低。本實(shí)驗(yàn)采用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)檢測(cè)凍后細(xì)胞的線粒體膜電位。細(xì)胞染色后在激光共聚焦顯微鏡(Nikon，Japan)下觀察，當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物產(chǎn)生紅色熒光，當(dāng)線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1無(wú)法聚集在線粒體基質(zhì)中，此時(shí)JC-1單體產(chǎn)生綠色熒光。通過(guò)胞內(nèi)紅綠熒光比例來(lái)衡量線粒體去極化的比例，從而判斷線粒體膜電位的變化，結(jié)果用紅綠熒光強(qiáng)度比值的平均值表示線粒體膜電位。

1.8數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSSStatistics19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Mean依SD表示，顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。每組實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3次以上。

2結(jié)果與討論

2.1傳統(tǒng)冷凍與微流控冷凍保存方案對(duì)卵母細(xì)胞存活率及體外發(fā)育的影響

采用微流控添加-去除保護(hù)劑法，并與3種不同的冷凍載體搭配使用，對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，卵母細(xì)胞的存活率和體外發(fā)育結(jié)果見表1。在QC及Cryotop中冷凍保存后，卵母細(xì)胞存活率(84.9%，89.45%)遠(yuǎn)高于在OPS中冷凍保存(66.69%)，且與對(duì)照組的存活率無(wú)顯著性差異。將不同保存方案的卵母細(xì)胞在冷凍后孤雌激活，并在培養(yǎng)2d后觀察卵裂率。OPS法、QC法、Cryotop法的卵裂率依次增高，為19.96%、26.58%、33.97%。

Table1Survivalratesandinvitrodevelopmentofoocytestreatedwithdifferenttraditionalandmicrofluidiccryopreservationprotocols

通過(guò)對(duì)比以上兩組試驗(yàn)還可以發(fā)現(xiàn)，微流控法添加-去除保護(hù)劑與不同冷凍載體搭配冷凍后，卵母細(xì)胞存活率和卵裂率均遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)法添加-去除保護(hù)劑與對(duì)應(yīng)冷凍載體搭配冷凍后的結(jié)果。說(shuō)明微流控添加-去除保護(hù)劑通過(guò)控制細(xì)胞周圍的溶液濃度連續(xù)變換，減少了細(xì)胞由于保護(hù)劑濃度突然增大或減小而受到的滲透壓突變沖擊，避免了細(xì)胞體積的大幅度變化，有效減少了細(xì)胞在保護(hù)劑添加-去除時(shí)的滲透損傷。其中，微流控添加-去除保護(hù)劑搭配Cryotop載體對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行低溫保存得到的存活率(89.45%)與對(duì)照組的存活率(90.45%)無(wú)顯著性差異，且得到的卵裂率(33.97%)顯著高于實(shí)驗(yàn)中其他冷凍方案的卵裂率。

2.2一體化微流控保存方案對(duì)細(xì)胞的存活率與體外發(fā)育的影響

卵母細(xì)胞在PDMS-透明陶瓷以及PDMS-玻璃一體化芯片低溫保存后的細(xì)胞存活率及體外發(fā)育情況，結(jié)果見表2。PDMS-透明陶瓷組的細(xì)胞存活率(59.79%)遠(yuǎn)高于PDMS-玻璃組的細(xì)胞存活率(33.4%)，將卵母細(xì)胞在冷凍后孤雌激活，并在培養(yǎng)2d后觀察卵裂率，PDMS-透明陶瓷組的細(xì)胞卵裂率為12.33%。實(shí)驗(yàn)中PDMS-透明陶瓷以及PDMS-玻璃一體化芯片冷凍結(jié)果的不同是由于陶瓷的導(dǎo)熱系數(shù)(46W/m窯K)遠(yuǎn)高于玻璃的導(dǎo)熱系數(shù)(0.7～1.1W/m窯K)。且選用的透明陶瓷芯片厚度為200微米，而選用的玻璃芯片厚度為1mm，傳熱阻力較大，因此PDMS-透明陶瓷芯片的保存效果優(yōu)于PDMS-玻璃芯片。

Table2Survivalratesandinvitrodevelopmentofoocytestreatedwithdifferentintegratedmicrofluidiccryopreservationprotocols

將以上結(jié)果與表1進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)PDMS-透明陶瓷組的冷凍保存與傳統(tǒng)添加-去除保護(hù)劑與OPS冷凍載體搭配的冷凍保存，兩者所得卵母細(xì)胞存活率(59.79%，55.80%)與卵裂率(12.33%，13.77%)無(wú)顯著性差異。但是，PDMS-透明陶瓷組的冷凍保存與傳統(tǒng)添加-去除保護(hù)劑與QC、Cryotop冷凍載體搭配的冷凍保存相比，卵母細(xì)胞的存活率與卵裂率均顯著低于后兩者。微流控一體化芯片的保存結(jié)果還不理想的原因在于：a。目前常用的芯片材料是PDMS，其鍵合技術(shù)、導(dǎo)管與芯片的密封技術(shù)都已發(fā)展成熟，但是PDMS的導(dǎo)熱系數(shù)較低(0.2W/m窯K)，限制了其冷凍速率，從而影響玻璃化冷凍效果，目前還未找到導(dǎo)熱系數(shù)高且加工技術(shù)成熟的芯片材料來(lái)代替PDMS芯片。b。在操作過(guò)程中，一體化芯片在添加保護(hù)劑后沒(méi)有將多余保護(hù)劑溶液從細(xì)胞腔中移除，升降溫過(guò)程中由于細(xì)胞周圍有較多溶液覆蓋，導(dǎo)致升降溫速率下降

2.3微流控冷凍后卵母細(xì)胞的凋亡情況

新鮮組、微流控添加-去除法搭配Cryotop方案組以及傳統(tǒng)添加-去除保護(hù)劑與OPS冷凍載體組卵母細(xì)胞的早期凋亡率、活性氧水平、線粒體膜電位見表3。細(xì)胞經(jīng)冷凍后，早期凋亡率顯著升高，但微流控組的卵母細(xì)胞早期凋亡率(39.44%)顯著低于傳統(tǒng)兩步法組(61.43%)；胞內(nèi)活性氧顯著升高，但微流控組的卵母細(xì)胞胞內(nèi)活性氧水平(11.9)顯著低于傳統(tǒng)兩步法組(13.19)；線粒體膜電位水平顯著降低，但微流控組的卵母細(xì)胞中線粒體膜電位水平(0.94)顯著高于傳統(tǒng)兩步法組(0.48)。可以看出，采用微流控法添加、去除保護(hù)劑并結(jié)合Cryotop法冷凍卵母細(xì)胞，可以有效降低卵母細(xì)胞的早期凋亡率和胞內(nèi)活性氧水平，并減小線粒體損傷，提高細(xì)胞的凍后質(zhì)量。

Table3Apoptosisrate,reactiveoxygenspeciesandmitochondrialmembranepotentialofoocytestreatedwithdifferentcryopreservationprotocols(n>40)

3結(jié)論

本文首先設(shè)計(jì)了用于添加-去除保護(hù)劑的微流控芯片，并首次與冷凍載體(OPS、QC、Cryotop)搭配，對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存實(shí)驗(yàn)。另外為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，首次選用玻璃及透明陶瓷作為基片制作了集CPA添加、冷凍、復(fù)溫、CPA去除為一體的透明PDMS-陶瓷、PDMS-玻璃一體化芯片并對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存。得出以下結(jié)論：

1.微流控添加-去除保護(hù)劑組卵母細(xì)胞凍后存活率以及培養(yǎng)后的卵裂率都顯著高于傳統(tǒng)添加-去除組，其中微流控添加-去除法搭配Cryotop方案的保存效果最優(yōu)且可以有效降低卵母細(xì)胞的早期凋亡率和胞內(nèi)活性氧水平，并減小線粒體損傷，提高細(xì)胞的凍后質(zhì)量。

2.PDMS-透明陶瓷一體化芯片的卵母細(xì)胞存活率遠(yuǎn)高于PDMS-玻璃一體化芯片，但僅與傳統(tǒng)添加-去除保護(hù)劑與OPS冷凍載體搭配的冷凍保存后所得卵母細(xì)胞存活率與卵裂率無(wú)顯著性差異，保存效果還不理想，在芯片材料選擇、芯片加工技術(shù)及凍存操作程序方面還有待進(jìn)一步的優(yōu)化。

微流控裝置搭配玻璃化冷凍載體可以有效改善保護(hù)劑添加-去除過(guò)程中細(xì)胞所受的滲透損傷和毒性損傷，提高卵母細(xì)胞的凍后存活率及質(zhì)量，可作為臨床應(yīng)用保存方案。另本文提出的微流控一體化芯片可以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，最大限度地減小卵母細(xì)胞受到的損傷，為卵母細(xì)胞的低溫保存提供新的思路，有廣闊的應(yīng)用前景。

文獻(xiàn)來(lái)源生物化學(xué)DOI:10.16476/j.pibb.2018.0016作者：周新麗郭瑩瑩衣星越等（轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）