3.1腦膠質(zhì)瘤芯片模型內(nèi)的細(xì)胞生長情況

通過分析U251芯片模型中培養(yǎng)的細(xì)胞的表型和活力，評估該模型內(nèi)腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的活性。在不改變培養(yǎng)條件的情況下，以1×107個/ml細(xì)胞密度接種構(gòu)建芯片模型，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行活力和表型分析。圖2A為明場下細(xì)胞形態(tài)，圖2B為模型內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)，U251細(xì)胞在芯片內(nèi)呈不規(guī)則的3D結(jié)構(gòu)生長。圖2C為培養(yǎng)48 h后U251細(xì)胞活/死評估的熒光圖像，絕大多數(shù)為呈現(xiàn)綠色熒光的活細(xì)胞，表明模型內(nèi)大部分細(xì)胞存活。與0 h芯片內(nèi)U251細(xì)胞活力相比，U251細(xì)胞在芯片中培養(yǎng)48 h后仍顯示出較高的活力水平（>91%），說明細(xì)胞在芯片內(nèi)培養(yǎng)48 h后生長狀態(tài)良好，可以用于后續(xù)的藥效評價研究（圖2D）。

3.2腫瘤微環(huán)境表征結(jié)果

在腫瘤細(xì)胞高速生長與增殖的過程中，往往會伴隨缺氧環(huán)境的形成。為確定芯片模型中U251細(xì)胞是否處于低氧環(huán)境，通過免疫熒光染色，對2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)模型中的U251細(xì)胞進(jìn)行HIF-1α的表征。如圖3所示，在3D培養(yǎng)的芯片模型中，缺氧狀態(tài)標(biāo)記物HIF-1α的熒光強度高于2D細(xì)胞培養(yǎng)模型，說明在3D培養(yǎng)條件形成的立體環(huán)境中，部分區(qū)域細(xì)胞處于相對缺氧狀態(tài)，可能產(chǎn)生更強的缺氧反應(yīng)；而在2D培養(yǎng)條件下，細(xì)胞間相互作用和信號傳導(dǎo)較為簡單，氧氣分布比較均勻，細(xì)胞的缺氧反應(yīng)相對較弱。

3.3模型內(nèi)陽性藥活性評價結(jié)果

為了評估該芯片模型在研究藥物抗腦膠質(zhì)瘤活性的適用性，分別考察了兩種抗腦膠質(zhì)瘤陽性藥物，即TMZ和DOC，在2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)條件下對細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖4所示。陽性藥TMZ和DOC對U251細(xì)胞具有一定程度的殺傷作用，隨著濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸降低；與2D培養(yǎng)相比，3D培養(yǎng)芯片模型內(nèi)的U251細(xì)胞在暴露于不同濃度TMZ（100、200、300、400 μmol/L）和DOC（2.5、5、10、20 μmol/L）的細(xì)胞活力均較高，其中，200 μmol/L和400 μmol/L的TMZ組（圖4A）和20 μmol/L的DOC組（圖4B）細(xì)胞活力均顯著高于相應(yīng)的2D培養(yǎng)組（P<0.05）。表明在相同濃度條件下，3D條件培養(yǎng)的芯片內(nèi)缺氧微環(huán)境或細(xì)胞外基質(zhì)能為細(xì)胞生長提供更穩(wěn)定的條件，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，從而表現(xiàn)出模型內(nèi)細(xì)胞活力更高。

3.4 陽性藥對模型內(nèi)細(xì)胞凋亡的影響

通過JC-1熒光探針監(jiān)測細(xì)胞線粒體膜電位，評估芯片模型內(nèi)細(xì)胞凋亡情況，以細(xì)胞活力更高的3D培養(yǎng)芯片模型作為研究平臺，并選擇陽性藥TMZ和DOC評價該芯片模型用于研究藥物抗腦膠質(zhì)瘤活性的可行性，結(jié)果如圖5所示。通常在健康細(xì)胞的線粒體內(nèi)，JC-1以高膜電位的紅色熒光聚集體形態(tài)存在；在不健康或發(fā)生凋亡的細(xì)胞線粒體中，JC-1則以綠色熒光的單體形式呈現(xiàn)。分別使用TMZ和DOC處理后，3D芯片模型內(nèi)U251細(xì)胞的紅/綠熒光強度比率隨著藥物濃度的增加而降低，說明細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位隨著陽性藥濃度的升高而下降，其中，400 μmol/L的TMZ組（圖5A）、10 μmol/L和20 μmol/L的DOC組（圖5B）與對照組相比，對U251細(xì)胞凋亡的影響有顯著性差異，說明這兩種陽性藥均可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡殺傷U251細(xì)胞。以上結(jié)果表明本研究所構(gòu)建的U251細(xì)胞微流控芯片模型具有評價藥物抗腫瘤藥效的能力，可以應(yīng)用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性評價和凋亡評價，為后續(xù)應(yīng)用于中藥抗腦膠質(zhì)瘤藥效評價奠定基礎(chǔ)。

3.5半枝蓮提取液抗腦膠質(zhì)瘤藥效評價

3.5.1對U251細(xì)胞的毒性實驗結(jié)果

采用CCK-8法考察不同濃度的半枝蓮提取液對U251細(xì)胞的毒性，確定適宜的給藥濃度。結(jié)果如圖6所示，在0.5～8 mg/ml的濃度范圍內(nèi)，U251細(xì)胞的存活率隨著半枝蓮提取液濃度的增加而降低。為確保所選藥物濃度能夠有效殺傷U251細(xì)胞，同時避免濃度過高導(dǎo)致的非特異性毒性，本研究選擇2 mg/ml的半枝蓮提取液進(jìn)行后續(xù)實驗。

3.5.2基于U251芯片模型的半枝蓮提取液抗腦膠質(zhì)瘤藥效評價

在所建立的U251芯片模型上考察半枝蓮提取液對U251細(xì)胞的殺傷作用，通過活/死細(xì)胞染色和凋亡實驗評價半枝蓮提取液的藥效，結(jié)果如圖7所示。2 mg/ml的半枝蓮提取液能在一定程度上降低細(xì)胞活力，與2D培養(yǎng)（平均細(xì)胞活力為64.82%）相比，3D培養(yǎng)的芯片上細(xì)胞活力更高（平均細(xì)胞活力為90.52%），提示在3D培養(yǎng)條件下可能需要更大劑量的半枝蓮提取液才能對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷效果。此外，凋亡實驗結(jié)果顯示，2D培養(yǎng)條件下有更多的細(xì)胞出現(xiàn)了線粒體膜電位降低的情況，而3D培養(yǎng)條件下呈綠色熒光的JC-1單體較少，說明3D培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生凋亡的較少。綜上表明半枝蓮提取液在一定程度上可以殺傷U251細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時提示基于傳統(tǒng)2D培養(yǎng)模型的藥物篩選或藥效評價結(jié)果與更接近體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的3D培養(yǎng)系統(tǒng)之間存在一定差距。

4.討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤的侵襲性和腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受性使治療面臨重大的挑戰(zhàn)。盡管醫(yī)學(xué)科學(xué)研究取得了重大進(jìn)步，但神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預(yù)后仍然較差，手術(shù)、放療和化療等傳統(tǒng)治療方法效果不佳。目前，體外研究采用的細(xì)胞模型僅提供微觀層面的信息，無法模擬腦和腦腫瘤的解剖、功能和微環(huán)境狀況。因此，近年來的研究專注于開發(fā)更先進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)模型，能夠更好地模擬腫瘤細(xì)胞與復(fù)雜微環(huán)境之間的相互作用，以腫瘤球體、類器官、3D打印和微流控芯片模型等為代表的3D培養(yǎng)方式可構(gòu)建較為理想的模擬腫瘤微環(huán)境的模型，為腫瘤細(xì)胞的增殖提供了合適的環(huán)境，并可作為體內(nèi)腫瘤誘導(dǎo)的載體，從而可以研究腫瘤生長、侵襲以及與免疫系統(tǒng)的相互作用。

腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞和非細(xì)胞成分都有助于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生，腫瘤微環(huán)境的改變可以促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、進(jìn)展、侵襲和治療耐藥性。基質(zhì)膠作為一種用于體外培養(yǎng)和模擬生物組織環(huán)境的生物材料，其物理性質(zhì)和功能上高度模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵特征，為腫瘤細(xì)胞提供支撐和3D結(jié)構(gòu)，有助于細(xì)胞黏附、生長和分化，可以更完整地在體外模擬腫瘤微環(huán)境。PDMS具有透氣性、透光性、生物相容性以及易加工和成本低等特征，本研究使用的微流控芯片模型集PDMS應(yīng)用優(yōu)勢和微流控在時空間維度精確控制的特點，實現(xiàn)模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)，為腦膠質(zhì)瘤體外模型構(gòu)建、藥效評價和藥物篩選提供靈活可控的研究平臺。

腦膠質(zhì)瘤動物模型因其存在基因和分子水平特征、腫瘤微環(huán)境等與人類存在差異、低通量、耗時長以及倫理問題等問題，細(xì)胞模型僅由腫瘤細(xì)胞組成，易發(fā)生遺傳變異和缺乏腫瘤微環(huán)境等缺點，導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤候選治療藥物在臨床前試驗評估的失敗率極高。與動物模型和傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞模型相比較，本研究采用人源的U251細(xì)胞構(gòu)建的腦膠質(zhì)瘤微流控芯片模型在形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及缺氧微環(huán)境的表達(dá)等方面更接近真實的腫瘤生長環(huán)境。作為體外研究模型，腫瘤細(xì)胞在該微流控芯片模型內(nèi)的存活率、凋亡和對治療的反應(yīng)等方面表現(xiàn)出更接近體內(nèi)的行為，更真實地評估模型內(nèi)腫瘤細(xì)胞對藥物或其他外界刺激產(chǎn)生的反應(yīng)。因此，本研究中建立的微流控芯片模型在研究腫瘤生長、侵襲、藥物評價和篩選具有一定優(yōu)勢。

腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療包括最大限度的手術(shù)切除、隨后的放療和TMZ同步化療，但許多小分子抑制劑和免疫治療策略都未能改善預(yù)后。中醫(yī)藥治療腦膠質(zhì)瘤具有一定優(yōu)勢，包括改善臨床癥狀、減輕放療和化療的不良反應(yīng)、提高患者生存質(zhì)量等。目前認(rèn)為中醫(yī)藥防治腦膠質(zhì)瘤的作用機制主要與改善腦膠質(zhì)瘤免疫抑制微環(huán)境，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及抑制其增殖、侵襲、遷徙，抑制腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)血管生成，調(diào)節(jié)BBB通透性，促進(jìn)氧化應(yīng)激相關(guān)，同時還能夠提高腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性，減輕其不良反應(yīng)，降低腫瘤耐藥性和復(fù)發(fā)的風(fēng)險。中藥半枝蓮具有清熱解毒，化瘀利尿的功效，現(xiàn)代藥理研究表明半枝蓮具有抗腫瘤、抗病毒、抑菌、消炎等作用，可通過抑制血管內(nèi)皮生長因子、缺氧誘導(dǎo)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)等，調(diào)控相關(guān)信號通路的相互作用，抑制腦膠質(zhì)瘤血管生成網(wǎng)絡(luò)機制的形成，發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的作用。有研究發(fā)現(xiàn)半枝蓮80%乙醇提取物對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有明顯的抑制遷移、侵襲作用，并具有濃度相關(guān)的抑制細(xì)胞存活率、促凋亡活性。He等研究發(fā)現(xiàn)半枝蓮活性成分野黃芩苷對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和LN229的增殖、遷移和凋亡均有抑制作用，其作用機制可能與抑制PSEN 1/PI 3 K-AKT信號通路有關(guān)。相比之下，本研究利用所構(gòu)建的更具生理相關(guān)性的腦膠質(zhì)瘤微流控芯片模型評價半枝蓮抗腦膠質(zhì)瘤作用。結(jié)果顯示，2 mg/ml的半枝蓮提取液能降低U251細(xì)胞的活力，通過降低線粒體膜電位誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步探究半枝蓮治療腦膠質(zhì)瘤及其作用機制提供實驗基礎(chǔ)。

綜上，本研究采用2D和3D培養(yǎng)方式構(gòu)建了模擬腫瘤微環(huán)境的腦膠質(zhì)瘤微流控芯片模型。綜合芯片上細(xì)胞活力評價、腫瘤微環(huán)境表征以及兩種抗腫瘤陽性藥物對該模型進(jìn)行表征并驗證。該模型成功應(yīng)用于中藥半枝蓮的抗腦膠質(zhì)瘤藥效評價，闡釋了半枝蓮?fù)ㄟ^誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)揮抗腦膠質(zhì)瘤作用，為中藥抗腦膠質(zhì)瘤藥效評價、機制研究以及活性成分快速篩選提供研究平臺。

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