單細(xì)胞異質(zhì)性在生理學(xué)、腫瘤學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、臨床診斷和治療等各個生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都得到了強(qiáng)調(diào)。先前微流控策略的方法學(xué)發(fā)展已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了動態(tài)單細(xì)胞操作、監(jiān)測和分析。由于其高通量、可控尺寸和獨(dú)立成分的使用，微流控液滴技術(shù)作為生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中基于細(xì)胞的高通量分析工具，如蛋白水解活性檢測、細(xì)胞因子分泌、和基因測序，引起了極大的關(guān)注。在這里，我們回顧了過去六年中在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引入的單細(xì)胞液滴應(yīng)用，包括小分子檢測、蛋白質(zhì)分析、藥物篩選分析和遺傳分析。

單細(xì)胞小分子檢測

在單細(xì)胞分析中檢測小分子是更好地了解生物體、探索細(xì)胞異質(zhì)性和早期診斷疾病的必要策略。細(xì)胞間小分子物質(zhì)，如乳酸和活性氧，廣泛參與細(xì)胞的信號通路，在許多生理和病理過程中起著重要作用。例如，癌癥的一個顯著特征是高葡萄糖代謝和乳酸生成。癌癥細(xì)胞通過有氧糖酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，這在細(xì)胞信號激活、增殖和疾病進(jìn)展中起著重要作用。單細(xì)胞液滴微流體最近被應(yīng)用于檢測這些小分子。Mongersun等人提出了一種液滴微流體方法，其中使用被動力將液滴包封的細(xì)胞放置到陣列中。該方法可以快速定量地確定許多單細(xì)胞中乳酸的釋放。通過使用商業(yè)乳酸試劑盒將乳酸轉(zhuǎn)化為熒光產(chǎn)品，單細(xì)胞中乳酸鹽的釋放速率由液滴熒光的增加決定。基于這種方法，他們開發(fā)了一種方法來確定K562白血病和U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在化學(xué)抑制乳酸流出條件下乳酸釋放的細(xì)胞間差異，這為研究高度異質(zhì)性的細(xì)胞群提供了一種新工具。Scoles小組在同一年使用帶有T連接通道的微流控液滴裝置也證明了轉(zhuǎn)移患者單個循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）中乳酸的熒光檢測。他們從20萬個血細(xì)胞中檢測到了10個腫瘤細(xì)胞。這項(xiàng)工作為涉及代謝的單一CTC識別提供了概念驗(yàn)證。

最近，徐的團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）-微流控液滴平臺，通過由銀納米粒子修飾的Fe3O4磁性微球組成的多功能磁性SERS底物，在單細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)了多重代謝物的無標(biāo)記同時分析（圖6A）。他們實(shí)現(xiàn)了三種單細(xì)胞代謝物的無標(biāo)簽、無損、同時測定：丙酮酸、三磷酸腺苷和乳酸。他們的金屬磁性復(fù)合基質(zhì)可用于實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞代謝物的有效吸附和從復(fù)雜基質(zhì)中的快速分離，并且具有很高的SERS靈敏度，使SERS微滴平臺成為在代謝水平上探索單細(xì)胞異質(zhì)性的有力工具。單細(xì)胞液滴也可以根據(jù)小分子動力學(xué)進(jìn)行分類。Zielke等人開發(fā)了一種液滴微流體裝置，用于基于糖酵解分離癌癥細(xì)胞亞群，這種方法不需要使用標(biāo)記物或活性分選成分。他們的技術(shù)用于控制特定表面活性劑環(huán)境下癌癥乳腺細(xì)胞糖酵解過程中質(zhì)子的分泌，以降低液滴的pH值。隨著液滴pH值的降低，液滴的界面張力增加，使不同糖酵解水平的細(xì)胞能夠分離。由于癌癥細(xì)胞暴露在不同的氧氣和營養(yǎng)環(huán)境中，它們的糖酵解反應(yīng)不同。該方法可用于根據(jù)選定的代謝差異將癌癥細(xì)胞與正常細(xì)胞分離，并鑒定具有相似物理特征的細(xì)胞。

細(xì)胞內(nèi)活性氧，如超氧陰離子和過氧化氫（H2O2），參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長和遷移、代謝調(diào)節(jié)、重要生物物質(zhì)合成和其他生理過程。劉的團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種高靈敏度的液滴微流體方法，用于定量測定不同類型的單細(xì)胞與金納米簇結(jié)合分泌的H2O2（圖6B）。單細(xì)胞分泌的130 H2O2可以誘導(dǎo)辣根過氧化物修飾的金納米簇發(fā)生顯著的熒光變化。他們的研究結(jié)果表明，快速生長的癌癥細(xì)胞可以產(chǎn)生比正常細(xì)胞系具有更高H2O2含量的分泌物，這為研究單細(xì)胞水平上H2O2分泌的細(xì)胞間差異提供了有用的工具。

抗壞血酸（AA），也稱為維生素C，是一種強(qiáng)抗氧化劑和酶反應(yīng)中的輔因子，可以預(yù)防自由基誘導(dǎo)的疾病，特別是帕金森病和癌癥。AA可以有效地清除與多種形式的組織損傷和疾病相關(guān)的有毒自由基和其他活性氧，這有助于開發(fā)簡單、快速和簡單的分析方法，用于高度選擇性和可靠地測量AA。最近，Alizadeh等人報道了一種液滴微流體方法，用于活細(xì)胞中AA的細(xì)胞內(nèi)成像（圖6C）。通過分離小微滴，他們能夠快速檢測和成像單個細(xì)胞中的AA。他們的傳感系統(tǒng)基于非氧化還原策略，其中應(yīng)用了熒光聚合物納米復(fù)合材料。他們的技術(shù)為研究單細(xì)胞提供了一種穩(wěn)健的方法和理想的平臺，并為臨床評估中的分子傳導(dǎo)生物學(xué)檢測提供了一個有前景的新工具。

4.2單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析

蛋白質(zhì)是一種在活細(xì)胞中具有特定功能的生物大分子，與細(xì)胞行為和代謝的特異性直接相關(guān)。不同細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)具有明顯的異質(zhì)性，單個細(xì)胞內(nèi)有許多類型的蛋白質(zhì)。盡管蛋白質(zhì)類型豐富，但具有重要功能的蛋白質(zhì)數(shù)量非常少。因此，基于單細(xì)胞的特異性蛋白質(zhì)的定量分析對于揭示群體中細(xì)胞的異質(zhì)性以改善由單細(xì)胞或一小組細(xì)胞引起的疾病（如癌癥）的早期診斷是非常重要的。流式細(xì)胞術(shù)是經(jīng)典的單細(xì)胞蛋白分析方法，可以通過免疫標(biāo)記各種功能蛋白來檢測特定功能蛋白的含量。然而，由于分泌蛋白的豐度低、缺乏足夠的靈敏度和細(xì)胞固定的要求，基于傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀對單細(xì)胞分泌的特定蛋白進(jìn)行動態(tài)檢測和分析仍然具有挑戰(zhàn)性。微液滴技術(shù)因其體積小、檢測靈敏度高、通量大，在單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析中具有廣闊的應(yīng)用前景。在下文中，我們討論了單細(xì)胞分泌的酶和細(xì)胞因子等蛋白質(zhì)的定量分析，以表達(dá)細(xì)胞群的異質(zhì)性。

在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，惡性腫瘤細(xì)胞突破周圍的生理屏障并遷移。腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞在體內(nèi)具有不同的遷移能力?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等分泌產(chǎn)物代表了有前景的藥物靶點(diǎn)和候選生物標(biāo)志物，并為評估癌癥轉(zhuǎn)移提供了有價值的信息，并基于對其活性的分析，允許篩選新的藥物來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生。 Yu等人報道了一種微流體方法，用于使用流動聚焦毛細(xì)管微流體設(shè)備檢測單個腫瘤細(xì)胞液滴中MMP9（MMPs的明膠酶亞群）酶活性（圖7A）。細(xì)胞分泌的MMP9能夠切割一對熒光團(tuán)/猝滅分子（FITC和DABCYL）修飾的肽。這可用于測量微滴中MMP9酶在熒光強(qiáng)度方面的活性，從而能夠以高再現(xiàn)性定量分析單個癌癥細(xì)胞分泌的MMP9的蛋白水解活性，以評估癌癥細(xì)胞的侵襲功能。該方法在檢測細(xì)胞侵襲性方面的超高靈敏度使其適用于細(xì)胞診斷和癌癥研究的高通量篩選。然而，由于載體油的流動性，現(xiàn)有的基于液滴的單細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）分析方法很少能夠連續(xù)跟蹤液滴的蛋白水解含量。為了改善這一點(diǎn)，Mu的團(tuán)隊(duì)描述了使用熱固性油通過一個過程實(shí)時監(jiān)測液滴的MMP分析，在這個過程中，液滴在形成后通過轉(zhuǎn)化為固體而固定（圖7B）。這種方法可以實(shí)時監(jiān)測單細(xì)胞蛋白水解活性，而不會損害液滴微流體的靈活性，從而可以根據(jù)實(shí)時熒光曲線計(jì)算反應(yīng)速率。該過程揭示的MMP活性的明顯細(xì)胞異質(zhì)性表明其在其他類型的基于細(xì)胞的高分辨率動態(tài)信息分析中的應(yīng)用潛力。

哺乳動物細(xì)胞（如免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和癌癥細(xì)胞）分泌的細(xì)胞因子在感染、免疫反應(yīng)、炎癥和疾病發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。特別是，細(xì)胞因子表達(dá)的增加與腫瘤血管形成和生長有關(guān)，這反過來可以產(chǎn)生新的腫瘤血管并擴(kuò)增現(xiàn)有的腫瘤血管。 Hsu等人建立了一種微流體液滴系統(tǒng)，用于高靈敏度的單細(xì)胞多重分泌組分析。和單核細(xì)胞趨化蛋白-1。該系統(tǒng)還可以在60分鐘內(nèi)測定6000個細(xì)胞的細(xì)胞分泌物的顯著異質(zhì)性。此外，徐的小組建立了SERS液滴微流體平臺，用于快速、超敏和同時檢測單個癌癥細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和IL-8（圖7C）。他們的結(jié)果表明，細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用可以通過上調(diào)VEGF和IL-8來促進(jìn)癌癥細(xì)胞的血管生成。這種方法的高靈敏度源于金屬等離子體增強(qiáng)和磁場誘導(dǎo)聚集的放大效應(yīng)，這使得含有單個細(xì)胞和四個免疫顆粒的油滴中形成高通量的水包水成為可能。此外，可以根據(jù)不同的排泄能力進(jìn)行細(xì)胞分選，以探索單細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的細(xì)胞間異質(zhì)性。這項(xiàng)技術(shù)為理解各種細(xì)胞因子在腫瘤血管化和侵襲性腫瘤生長中的生物學(xué)作用提供了一種新方法。最近，Wimmers等人提出了一種微流體單細(xì)胞液滴系統(tǒng)，用于免疫熒光檢測人漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDC）中I型干擾素（IFN）的產(chǎn)生。I型IFN是與感染和癌癥相關(guān)的免疫的關(guān)鍵細(xì)胞因子。他們的結(jié)果支持I型干擾素的產(chǎn)生僅限于少量單獨(dú)刺激的pDCs，并表明pDC驅(qū)動的I型干擾素產(chǎn)生存在隨機(jī)差異。此外，袁等人使用微流體裝置將單個自然殺傷NK-92 MI細(xì)胞及其K562靶細(xì)胞快速包封到微滴中，以提高單個細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。微滴包封可以防止分泌物擴(kuò)散到相鄰細(xì)胞，并顯著降低非微流體微滴方法下獲得的假陽性和陰性率。

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