殺菌劑在農(nóng)業(yè)中廣泛用于控制真菌病原體，這些病原體對植物產(chǎn)量和質(zhì)量產(chǎn)生重大經(jīng)濟(jì)影響。傳統(tǒng)的抗真菌篩選技術(shù)，如水瓊脂和 96 孔板，基于費(fèi)力的方案和批量分析，限制了單孢子水平的分析，并且非常耗時(shí)。在這項(xiàng)研究中，我們提出了一種基于液滴的微流控平臺(tái)，可以對絲狀真菌鏈格孢的單個(gè)孢子進(jìn)行抗真菌分析。開發(fā)了一種基于液滴的活力測定法，允許液滴內(nèi)單個(gè)互花米孢子的萌發(fā)和菌絲生長。在24 h的時(shí)間內(nèi)證明了活力，并使用Kunshi/Tezuma作為抗真菌劑進(jìn)行了抗真菌篩選。將基于液滴的抗真菌分析的療效結(jié)果與常規(guī)方案的結(jié)果進(jìn)行比較和驗(yàn)證。基于液滴的平臺(tái)評(píng)估的抑制百分比與其他兩種方法獲得的抑制百分比相同，Pearson相關(guān)性分析顯示三種檢測之間的高度相關(guān)性。綜上所述，這種基于液滴的微流控平臺(tái)為分析殺菌劑抗性發(fā)展以及其他抗菌劑甚至拮抗真菌的組合篩選提供了廣泛的潛在應(yīng)用。

植物病原真菌每年破壞三分之一的糧食作物，造成經(jīng)濟(jì)損失并影響全球貧困。在這些植物病原真菌中，鏈格孢菌會(huì)引起馬鈴薯作物的褐斑病。褐斑病，俗稱“另一種早疫病”，是馬鈴薯的一種重要病害。癥狀包括出現(xiàn)在葉子背面的小圓形棕色病變。該病有可能使產(chǎn)量降低多達(dá) 30%，當(dāng)病害得不到控制時(shí)，還報(bào)告了高達(dá) 70-80% 的損失。在儲(chǔ)存過程中，互花米草會(huì)在塊莖上造成黑坑，導(dǎo)致收獲后損失 10%。幾種殺菌劑用于控制疾病、提高生產(chǎn)力和延長收獲作物的儲(chǔ)存壽命。大量使用特定地點(diǎn)的殺菌劑會(huì)導(dǎo)致互花米草和各種其他真菌產(chǎn)生殺菌劑抗性，這需要發(fā)現(xiàn)新的抗真菌劑。新殺菌劑的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)面臨著巨大的挑戰(zhàn)，包括 （a） 篩選大型抗真菌候選藥物庫以評(píng)估其功效、植物毒性和其他可能的影響，（b） 廣泛的研究推動(dòng)的產(chǎn)品開發(fā)成本高昂，以及 （c） 復(fù)雜的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。一種新的作物保護(hù)產(chǎn)品大約需要 10 年時(shí)間，開發(fā)成本約為 2.6 億美元。對于抗真菌篩選，使用各種常規(guī)技術(shù)，包括瓊脂平板和 96 孔平板。然而，不同的分析方法可能會(huì)導(dǎo)致不同的靈敏度，影響測試結(jié)果的可靠性和可用性，從而影響“真正的命中”作為針對特定真菌的抗真菌劑的選擇。敏感性的差異可能會(huì)根據(jù)觀察到的殺菌劑反應(yīng)得出有偏差的結(jié)論，并取決于所使用的方案。此外，多孔平臺(tái)的一些主要局限性是所需的昂貴實(shí)驗(yàn)試劑和耗材的數(shù)量、耗時(shí)費(fèi)力的方案以及封閉的系統(tǒng)設(shè)計(jì)。經(jīng)典方法在單孢子分析方面也存在局限性，并且處理和可重復(fù)性等特殊困難可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中觀察結(jié)果之間的相當(dāng)大的差異。因此，重要的是要建立一種新的經(jīng)過驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)化抗真菌分析方法，以克服這些限制。

微流控方法的進(jìn)步推動(dòng)了尋找專門針對抗真菌劑的新分子靶點(diǎn)的搜索。在過去的二十年中，微流控技術(shù)一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，因?yàn)樗c傳統(tǒng)檢測相比具有優(yōu)勢，例如（a）將臺(tái)式實(shí)驗(yàn)室縮小到芯片，（b）試劑消耗低，（c）高通量（HT）分析，（d）縮短分析時(shí)間，（e）監(jiān)測高空間和時(shí)間分辨率，（f）觀察許多細(xì)胞的動(dòng)態(tài)行為（g） 提供有關(guān)異質(zhì)微生物群體中細(xì)胞間變異的信息 和 （h） 研究真菌之間的菌絲相互作用。這些優(yōu)點(diǎn)使微流控設(shè)備成為抗真菌篩選和分析的多功能工具。在不同的微流控方法中，基于液滴的微流控技術(shù)已成為傳統(tǒng)微量滴定板方法的一種越來越有趣的替代方案，用于真菌的酶促HT篩選。這些方法可以為單孢子封裝提供另一種方法，并有可能成為大規(guī)?？拐婢治龅挠辛ぞ?。盡管基于液滴的微流控具有快速、經(jīng)濟(jì)高效的HT篩選的潛力，但目前尚未用于常規(guī)抗真菌測試和分析，這很可能是考慮到技術(shù)困難，例如不同的培養(yǎng)表面、減少的培養(yǎng)基體積以及微流控工具所代表的培養(yǎng)基交換速率和方法大不相同對于大多數(shù)有經(jīng)驗(yàn)的植物生物學(xué)家來說。重要的是，將植物病原真菌的單個(gè)孢子封裝到液滴中，被視為微反應(yīng)器，可以防止惡劣的外部環(huán)境條件，使孢子的物理和化學(xué)分離成為可能，并減少被外來生物污染的機(jī)會(huì)。此外，通過向液滴中注射不同的試劑選擇性地提供營養(yǎng)物質(zhì)或抗真菌劑，通過增強(qiáng)對微環(huán)境的動(dòng)態(tài)控制，可以在單個(gè)孢子水平上觀察殺菌劑分子機(jī)制，從而獲得對殺菌劑分子機(jī)制的新見解。如今，有各種成熟的封裝單個(gè)孢子的技術(shù)，包括逐層沉積、溶劑蒸發(fā)和界面聚合。然而，這些技術(shù)使用各種細(xì)胞毒性化合物、腐蝕性化學(xué)品或有機(jī)溶劑，這會(huì)危及封裝生物的活力。因此，基于液滴的方法應(yīng)對這些挑戰(zhàn)并使用生物相容性試劑可能有可能逐步過渡到單孢子分析，以進(jìn)行常規(guī)測定的抗真菌篩選，這最終可能會(huì)徹底改變殺菌劑的開發(fā)方式以及如何控制真菌中的殺菌劑耐藥性。

本研究的主要目的是建立一種簡單的微流體裝置，能夠 （a） 封裝真菌的單個(gè)孢子，（b） 進(jìn)行抗真菌分析，以及 （c） 量化基于梯度的抗真菌劑量反應(yīng)。本文描述的平臺(tái)允許在密閉的微環(huán)境中評(píng)估抗真菌劑對孢子萌發(fā)的直接影響，具有高可重復(fù)性，并且能夠使用廣泛可訪問的顯微鏡圖像分析對孢子萌發(fā)進(jìn)行定量。我們的設(shè)計(jì)結(jié)合了微米級(jí)的陷阱，這些陷阱限制了封裝的孢子，允許它們隨著時(shí)間的推移通過明場顯微鏡進(jìn)行個(gè)體可視化和評(píng)估。為了驗(yàn)證使用微流控平臺(tái)的抗真菌評(píng)估結(jié)果，我們還使用兩種常規(guī)方法進(jìn)行了評(píng)估實(shí)驗(yàn)，即水瓊脂 （WA） 和 96 微量滴定板。在本研究中，我們展示了具有精確流體控制的基于液滴的抗真菌分析平臺(tái)的設(shè)計(jì)和表征，作為嚴(yán)格、可重復(fù)、單孢子包封和抗真菌分析的新基準(zhǔn)。

結(jié)果

將單個(gè)孢子封裝在微流體液滴中

通過將一層聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 粘合到載玻片上，將微通道壓印到表面 50 μm 上，構(gòu)建了單孢子封裝的裝置。通過將結(jié)構(gòu)化的PDMS表面粘合到載玻片上，創(chuàng)建了通道和兩個(gè)入口，第一個(gè)用于油（含表面活性劑），第二個(gè)用于孢子懸浮液（半強(qiáng)度PDB）。半強(qiáng)度PDB用于避免孢子萌發(fā)的變異性。噴嘴的尺寸為50μm，液滴是通過用兩股含有表面活性劑的氟化油流對水流進(jìn)行流動(dòng)聚焦而產(chǎn)生的（圖2a）。所設(shè)計(jì)的芯片能夠在油中PDB中產(chǎn)生單分散液滴，并在PDB中封裝互花格孢的單個(gè)孢子（圖2a，b）。為了設(shè)定單孢子包封的最佳條件，測試了油和孢子懸浮液的各種壓力。發(fā)現(xiàn) 100 μm 的液滴大小最適合單個(gè)互花米孢子的萌發(fā)，同時(shí)在孵育 24 小時(shí)后為菌絲生長留出足夠的空間（圖 4b、c）。將單個(gè)孢子封裝在液滴中允許支鏈菌絲網(wǎng)絡(luò)在液滴中生長長達(dá) 24 小時(shí)。包封后4 h和24觀察生長。包膜的孢子在萌發(fā)、細(xì)胞壁發(fā)育或菌絲生長方面沒有表現(xiàn)出任何異常（圖2c）。將液滴從芯片外收集在裝滿油和表面活性劑的小瓶中。液滴尺寸系數(shù)變化（CV）為1%（即單分散液滴）。CV是表示液滴單分散性或多分散性的系數(shù)變化。值得注意的是，液滴的大小和頻率通常取決于所用液體的壓力、流速和粘度。圖2d顯示了施加在兩種液體上的壓力所產(chǎn)生的液滴大小。

用于片上抗真菌分析的微流控平臺(tái)

抗真菌分析平臺(tái)包括OB1流量控制器、管路、連接器、50 mL聚苯乙烯管、聚碳酸酯（PC）微流控芯片（疏水通道）和用于觀察的光學(xué)顯微鏡（圖3a）。OB1 壓力控制器用于以高通量可靠地產(chǎn)生單分散液滴 （CV < 3%）。由于PDMS可能吸收小疏水分子，如孢子衍生的生物分子和藥物，這些芯片用于對系統(tǒng)中的孢子進(jìn)行活力測定，并優(yōu)化液滴尺寸以進(jìn)行封裝。對于最終的微流控分析平臺(tái)，使用了由PC制成的芯片（圖3b）。市售芯片由兩個(gè)不同的部分組成：（1） 液滴制造器和 （2） 液滴存儲(chǔ)位置（總共 2261 個(gè)）。滴劑制造器允許用特定濃度的殺菌劑封裝單個(gè)孢子（圖 3c）。微流控芯片的結(jié)構(gòu)旨在通過合并兩股水流來通過流體動(dòng)力流聚焦產(chǎn)生液滴：一種攜帶孢子懸浮液，另一種攜帶特定濃度的殺菌劑。含有孢子懸浮液和抗真菌劑（kunshi）的培養(yǎng)基PDB分別以200 mbar泵送，同時(shí)以210 mbar HFE7500濃度泵送氟化油+ 1%v/v表面活性劑，微調(diào)壓力允許水性流體1：1混合。將得到的 100 μm 大小的液滴捕獲在芯片上的特定存儲(chǔ)位置孵育 24 小時(shí) （Fig. 3d–g）。誘捕器允許在孵育4小時(shí)和24小時(shí)時(shí)觀察每個(gè)孢子的可視化。每小時(shí)產(chǎn)生103個(gè)液滴（直徑為100μm）×液滴的通量為5.4個(gè)（油壓=210mbar，孢子懸浮壓力=200mbar，殺菌劑壓力=200mbar）。根據(jù)泊松分布定律，每滴平均孢子數(shù)（λ）為0.01，單孢子滴為70個(gè)（n=12），占有率為0.03%。具有兩個(gè)孢子的液滴數(shù)量為8個(gè)（n = 12），占有率為0.003%。無孢子的液滴數(shù)量為2183個(gè)（n = 12），空液滴占有率為0.965%。在t = 0 h（100μm），t = 4 h（99.97μm）和t = 24 h（99.47μm）時(shí)計(jì)算液滴大小。在實(shí)驗(yàn)過程中，通過提供培養(yǎng)基和無菌環(huán)境，在液滴內(nèi)保持最佳生長條件。

該平臺(tái)通過將單個(gè)孢子封裝在具有特定濃度的坤孢的液滴中，評(píng)估坤石對鏈格孢菌孢子萌發(fā)的抗真菌功效?？偣彩褂昧似叻N不同濃度的昆氏，范圍從0.015到6μgμL?1。6 μg μL?1 的劑量在孵育 4 h 和 24 h 后萌發(fā)最多減少 98.6%，顯著高于對照組 （P < 0.05）。在0.015 μg μL?1濃度下，孢子萌發(fā)減少最少（6.9%），顯著高于對照組（P < 0.05）。與對照組相比，所有濃度（孵育后4小時(shí)和24小時(shí)）均表現(xiàn)出顯著高的抑制百分比（P < 0.05）（圖4a，b）。此外，每個(gè)濃度的4和24 h時(shí)間點(diǎn)之間的抑制百分比彼此之間沒有顯著差異（P < 0.05）。

與殺菌劑孵育4 h和24 h后，坤石對互花米草孢子萌發(fā)的抗真菌活性表現(xiàn)為EC50（中位抑制濃度）。資料顯示，坤石對鏈格孢菌孢子萌發(fā)具有劑量依賴性抗真菌活性。在4小時(shí)和24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，EC50的總值范圍為0.125至0.25μgμL-1（表1）。

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