摘 要 ： 快速、準(zhǔn)確地檢測病原微生物對(duì)于疫情防控和保障人民生命健康具有重大意義。近幾年，研究者們通過合理地設(shè)計(jì)微流控芯片，將微流控技術(shù)與各種檢測技術(shù)相結(jié)合，已經(jīng)開發(fā)出了多種用于病原微生物檢測的技術(shù)方法。相較于傳統(tǒng)的病原微生物檢測技術(shù)，微流控檢測技術(shù)優(yōu)勢(shì)突出，具有操作人員技術(shù)要求不高、樣本需求量少和自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于各種復(fù)雜環(huán)境下病原微生物的精準(zhǔn)、快速檢測。本文對(duì)微流控技術(shù)在病毒、細(xì)菌、真菌、衣原體及支原體等病原微生物的檢測應(yīng)用進(jìn)行了綜述，以期為病原微生物的檢測提供研究思路，促進(jìn)微流控技術(shù)在病原微生物檢測中的發(fā)展，提高對(duì)疾病的預(yù)防和控制能力。

病原微生物是指能夠引起人類或動(dòng)物疾病的微生物，包括病毒、細(xì)菌、真菌、衣原體和支原體等。病原微生物可以通過空氣、體液等介質(zhì)傳播，危害人體健康，造成財(cái)產(chǎn)損失。因此，對(duì)病原微生物快速、準(zhǔn)確以及靈敏的檢測是降低其危害的重要手段。傳統(tǒng)的病原微生物檢測方法包括染色、培養(yǎng)、生化鑒定等方法，存在耗時(shí)長、成本高、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。微流控技術(shù)的出現(xiàn)為病原微生物的低成本、高通量、高效率檢測提供了新的研究思路和方法。本文基于微流控技術(shù)在不同病原微生物檢測中的研究進(jìn)展作一綜述，旨在為微流控技術(shù)在病原微生物檢測中的研究提供參考，進(jìn)而推動(dòng)微流控技術(shù)在病原微生物檢測中的應(yīng)用。

1 微流控概述及其分類

1.1 微流控的簡介

微流控（microfluidics）指的是使用微管道（尺寸為數(shù)十到數(shù)百微米）處理或操縱微小流體（體積為納升到阿升）的系統(tǒng)所涉及的科學(xué)和技術(shù)。微流控系統(tǒng)通常包含閥門、微通道、反應(yīng)室、壓力系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)，通過控制微流控裝置內(nèi)流體的運(yùn)動(dòng)來實(shí)現(xiàn)樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測等功能。微流控技術(shù)能夠控制微小流體，整合多種反應(yīng)，其在病原微生物檢測中可以在微觀水平上精確控制樣品體積并減少體內(nèi)和體外環(huán)境之間的差異，進(jìn)而達(dá)到縮短反應(yīng)時(shí)間和降低檢測成本的目的，具有快速、準(zhǔn)確、樣品消耗少等優(yōu)點(diǎn)，為病原微生物的檢測提供了廣闊的前景。微流控技術(shù)在病原微生物檢測中的應(yīng)用如圖 1。

圖 1 微流控在病原微生物檢測中應(yīng)用

1.2 微流控技術(shù)的分類

微流控技術(shù)發(fā)展迅速，種類眾多，應(yīng)用十分廣泛，對(duì)于微流控技術(shù)種類的劃分還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)?；谖⒘骺匦酒尿?qū)動(dòng)方式可將其分為主動(dòng)型微流控和自驅(qū)型微流控。主動(dòng)型微流控一般利用的是外源性驅(qū)動(dòng)力進(jìn)行微流體的操控，主要包括壓力型微流控、離心型微流控、磁力型微流控、數(shù)字化微流控等。各類型微流控特點(diǎn)如下 ：（1）壓力型微流控 ：利用氣體壓力或液壓或氣液壓混合，來控制液體在芯片中的運(yùn)動(dòng)；（2）離心型微流控：一般為對(duì)稱盤式構(gòu)型，利用旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力來驅(qū)動(dòng)液體在芯片中的運(yùn)動(dòng)；（3）磁力型微流控 ：利用磁場來控制流體中的磁性物質(zhì)，以驅(qū)動(dòng)流體的運(yùn)動(dòng) ；（4）數(shù)字化微流控 ：基于微升至納升范圍內(nèi)的液滴精準(zhǔn)操作，來實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室分析的獨(dú)立平臺(tái)，其微滴由液體表面張力特性形成。上述是常見的幾種微流體驅(qū)動(dòng)方式，研究人員通常將多種驅(qū)動(dòng)方式組合來實(shí)現(xiàn)特定的目標(biāo)功能。

自驅(qū)型微流控通常利用表面親疏水特性或毛細(xì)力來進(jìn)行流體的輸運(yùn)與處理，具有自驅(qū)動(dòng)、無需外接動(dòng)能、操作方便和容易控制等特點(diǎn)。其原理是基于紙質(zhì)材料的易塑形、多孔、親水、毛細(xì)管作用等特性進(jìn)行物理或化學(xué)加工后構(gòu)建出的平面（2D）或立體（3D）的紙基微流道，該微流道集樣品前處理、分離、分析等功能于一體，可實(shí)現(xiàn)微量樣本的快速檢測。目前文獻(xiàn)所報(bào)道的微流控裝置多是外源驅(qū)動(dòng)型微流控，而高通量、低能耗或無需外源驅(qū)動(dòng)的微流控檢測技術(shù)是未來主要發(fā)展趨勢(shì)。

2 微流控技術(shù)在病原微生物檢測中的應(yīng)用

2.1 微流控技術(shù)檢測病毒

基于微流控技術(shù)的病毒檢測方法主要針對(duì)病毒細(xì)胞數(shù)量、表面特異性蛋白和特異性核酸片段來開展檢測?；诓《炯?xì)胞培養(yǎng)的空斑測定法是病毒鑒定和診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在通量低、所需樣品量大等問題，因此 Su 等設(shè)計(jì)了可以同時(shí)培養(yǎng) 5種病毒的聚二甲硅氧烷芯片，該芯片系統(tǒng)不僅實(shí)現(xiàn)了病毒的高效鑒定，還完成了病毒的分離和抗病毒藥物的篩選，具有通量高和檢測樣本量少的優(yōu)點(diǎn)。

微流控芯片培養(yǎng)法解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)法存在的一些問題，但仍存在培養(yǎng)周期長等限制，所以需要開發(fā)耗時(shí)少、精確度高的檢測方法。而靶向病毒表面特異蛋白的微流控技術(shù)可以很好地解決目前培養(yǎng)法存在的問題，因而，Saraf 等基于適體和適體功能化的金納米粒子與目標(biāo)蛋白形成三明治夾心結(jié)構(gòu)，然后和銀試劑反應(yīng)獲得比色信號(hào)，設(shè)計(jì)了對(duì)寨卡病毒和基孔肯雅病毒等病毒包膜蛋白進(jìn)行多重檢測的微流控檢測芯片，該芯片系統(tǒng)在 2 h 內(nèi)完成了對(duì)磷化氫緩沖鹽水和小牛血中寨卡病毒和基孔肯雅病毒的高特異性檢測。為了在微流控檢測系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)對(duì)多靶標(biāo)蛋白的靈敏識(shí)別，Guan 等設(shè)計(jì)了一個(gè)集成兩種單克隆抗體（mAb）的微流體系統(tǒng)，用于腸道病毒 71（EV71）的靈敏檢測。該系統(tǒng)將 EV71 的主要衣殼蛋白 VP1 的單克隆抗體 1F4 和 2H2 分別與羧基官能化磁珠和羧基官能化量子點(diǎn)偶聯(lián)，最后通過熒光強(qiáng)度來直接評(píng)估靶標(biāo)蛋白的濃度。該微流體系統(tǒng)在 30 min 內(nèi)對(duì) VP1 的檢測限（LOD）達(dá)到 10pg/mL，與使用相同抗體的夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的結(jié)果（310 pg/mL）相比，提升了 31 倍。

隨著技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，基于病毒表面特異蛋白的微流控技術(shù)在耗時(shí)、特異性以及靈敏度等方面均有很大的提升，但是面對(duì)低豐度、高感染性的病毒靶標(biāo)時(shí)，仍存在靈敏度不夠的問題，而以精確度高著稱的核酸檢測法可以彌補(bǔ)蛋白檢測法存在的缺陷。基于此，Tian 等開發(fā)了一種檢測病毒特異性核酸序列的全自動(dòng)離心微流控系統(tǒng)（圖2?a），所有檢測流程被整合到封閉的自動(dòng)化微流體系統(tǒng)之中，當(dāng)口咽拭子樣品被注入微流控盤后，該系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行樣品處理、反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、熒光信號(hào)檢測等檢測流程，其在 70 min 內(nèi)完成了對(duì) 21 個(gè)樣本的高靈敏檢測，最低檢測限達(dá)到 0.5copies/μL。而當(dāng)面對(duì)致病率極高的病毒時(shí)，快速且高效地篩查出陽性患者是有效開展防疫工作的保障，因此，Li 等基于一個(gè)獨(dú)立的微流控系統(tǒng)開發(fā)了一種簡單、靈敏和無需儀器的病毒檢測系統(tǒng)（圖 2?b）。

圖 2 病毒檢測微流控系統(tǒng)

該系統(tǒng)將等溫?cái)U(kuò)增、CRISPR 技術(shù)和側(cè)向流動(dòng)檢測集成在一個(gè)封閉的微流體芯片中，當(dāng) RNA 病毒樣本加入到微流控芯片后，通過側(cè)向流動(dòng)試紙，肉眼即可直接觀測檢測結(jié)果。這種操作簡單、靈敏度高、成本低的微流控系統(tǒng)有望被推廣應(yīng)用到大規(guī)模的病毒篩查檢測中。

目前常見的微流控系統(tǒng)通常需要外源驅(qū)動(dòng)，所以動(dòng)力供應(yīng)會(huì)限制微流控技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。基于此，Yao 等設(shè)計(jì)了一種自供電快速加載微流控芯片（圖 2?c），可同時(shí)檢測裂谷熱病毒、基孔肯亞病毒和登革熱病毒 I、II、III 和 IV 亞型等 8 種病毒，無需外源驅(qū)動(dòng)，50 min 內(nèi)即可完成檢測，靈敏度可達(dá) 50-100 copies/μL。Kim 等研究發(fā)現(xiàn)具有毛細(xì)作用力的紙基微流控在無外源驅(qū)動(dòng)條件下即可實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的捕獲和檢測，利用其獨(dú)有的特性開發(fā)了一種手持式紙基微流控系統(tǒng)，可直接捕獲空氣中的液滴進(jìn)行檢測。通過在空氣中噴灑含有病毒的人類唾液樣本來模擬自然環(huán)境，驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)從捕獲病毒到智能手機(jī)完成數(shù)據(jù)分析總耗時(shí) 30 min。這項(xiàng)技術(shù)為提高微流控系統(tǒng)的病毒檢測效率提供了新思路。

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