剪切誘導(dǎo)結(jié)晶的定量

雖然上述展示了一種微流控平臺(tái)，能夠誘導(dǎo)重組MaSp2快速自組裝成分層結(jié)構(gòu)的纖維，以響應(yīng)連續(xù)的生理觸發(fā)，但另一個(gè)主要問題是這樣的系統(tǒng)是否能夠成功誘導(dǎo)β片結(jié)構(gòu)的形成，這是蜘蛛絲拉伸強(qiáng)度的主要來(lái)源。

通過共聚焦拉曼光譜監(jiān)測(cè)微流控芯片內(nèi)蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，分辨率為0.8 cm?1（圖3a）。從天然蜘蛛拉索絲纖維中收集的光譜用作參考，在1670（酰胺I，C = O拉伸），1615（Tyr），1452（CH3不對(duì)稱彎曲，CH2彎曲），1242（酰胺III，N-H彎曲+ C-N拉伸），1175（Tyr）和~1078/1094 cm?1（骨骼Cα-Cβ拉伸）的預(yù)期位置產(chǎn)生了明確的峰。在這些峰中，酰胺I、酰胺III和骨架C-C峰對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化很敏感，特別是關(guān)于β片構(gòu)象31。通常，可以對(duì)酰胺I或III區(qū)域內(nèi)的峰進(jìn)行反卷積以計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)組成32。然而，PDMS和蓋玻片分別在1266和1098 cm?1處產(chǎn)生重疊信號(hào)，因此我們專注于酰胺I區(qū)域周圍的區(qū)域，以定量分析二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。初步測(cè)試證實(shí)，在微流體環(huán)境之外，暴露于仿生化學(xué)觸發(fā)物的三域MaSp2，但在沒有機(jī)械變形的情況下，未能產(chǎn)生β片構(gòu)象（圖3b）;而作為陽(yáng)性對(duì)照，經(jīng)90%甲醇處理的MaSp2縮合物在1668 cm?1處產(chǎn)生了β片構(gòu)象的特征酰胺I峰。

使用 N-R6-C、N-R12-C 和 N-R12-C（xA） 進(jìn)行的拉曼測(cè)量揭示了在微流控裝置中自組裝過程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的演變（圖 3c），補(bǔ)充了觀察到的形態(tài)變化。在LLPS液滴狀態(tài)（A部分）期間，所有樣品的光譜都與大部分無(wú)序/a螺旋構(gòu)象一致，峰值為~1654 cm?1。值得注意的是，對(duì)于N-R12-C，觀察到在~1664 cm?1處逐漸出現(xiàn)一個(gè)額外的峰，這歸因于β片結(jié)構(gòu)。從1580到1720 cm?1的酰胺I區(qū)域的反卷積提供了二級(jí)結(jié)構(gòu)貢獻(xiàn)的估計(jì)。如附表2所示，N-R12-C的估計(jì)β片含量從A部分的12.5%增加到B部分的22.5%，最后增加到C部分的最高29.2%。相比之下，對(duì)于N-R6-C，串聯(lián)重復(fù)次數(shù)只有一半，盡管組裝了形態(tài)相似的纖維，但未檢測(cè)到明顯的β片峰;我們假設(shè)觸發(fā) 6 重復(fù)結(jié)構(gòu)中結(jié)構(gòu)變化的壓力閾值高于 12 重復(fù)結(jié)構(gòu)，施加的壓力為 -90 kPa（我們系統(tǒng)的上限）顯然不足以驅(qū)動(dòng) N-R6-C 中豐富的β片形成。同樣，對(duì)于突變體N-R12-C（xA），沒有觀察到二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，這與聚丙氨酸形成蠶絲纖維β片晶體成分的基礎(chǔ)一致。

值得注意的是，雖然N-R12-C在A段中受到的剪切力略高于B段（圖4c，e），但在后一段中檢測(cè)到β片含量的顯著增加。因此可以推斷，A部分中離子交換引發(fā)的剪切和LLPS的簡(jiǎn)單組合不足以誘導(dǎo)構(gòu)象轉(zhuǎn)變。因此，很明顯，B部分中酸化引起的纖維化，以及相關(guān)的粘度增加，也是我們微流控系統(tǒng)中β片形成協(xié)同過程的必要先決條件。

為了檢驗(yàn)觸發(fā)β片涌現(xiàn)的閾值假設(shè)，在不同大小的負(fù)壓下進(jìn)行N-R12-C的微流控組裝（圖.3d）。在較低水平（-40至-50 kPa）下，沒有獲得纖維，而是蛋白質(zhì)形成聚集體。相反，在-60至-90 kPa之間形成了分層纖維，負(fù)壓的大小與β片構(gòu)象的比例呈正相關(guān)（圖3e）。有趣的是，?60 kPa被證實(shí)是蠶絲纖維形成的閾值壓力，其平均β片含量為17.8%。隨著壓力的增加，β片含量逐漸增加21.5%（?70 kPa時(shí)）、23.7%（?80 kPa時(shí)）和28.9%（?90 kPa時(shí)）。假設(shè)如果壓力超過受我們實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)限制的?90 kPa，則可以在蠶絲纖維中誘導(dǎo)更多的β片。這一結(jié)果表明，通過施加壓力的細(xì)微變化來(lái)調(diào)整纖維結(jié)構(gòu)的潛力。

在離開蜘蛛的噴絲頭后，通常會(huì)對(duì)拉絲進(jìn)行進(jìn)一步拉伸，以實(shí)現(xiàn)更高程度的結(jié)晶和取向。這種自然行為代表了與強(qiáng)制卷蠶絲和后拉絲紡纖維相同的原理。因此，我們研究了通過我們的微流控裝置與手動(dòng)拉絲纖維可以實(shí)現(xiàn)的β片形成的相對(duì)水平（圖3f）。雖然使用手動(dòng)拉伸方法無(wú)法誘導(dǎo)精確的 pH 梯度和剪切，但手動(dòng)拉伸產(chǎn)生的伸長(zhǎng)力通常被認(rèn)為是強(qiáng)大的，并且是充分誘導(dǎo)β片的原因。雖然微流控系統(tǒng)可以驅(qū)動(dòng)重組絲纖維的免提仿生組裝，但與手動(dòng)拉制相分離MaSp2（即使在較短的N-R6-C結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生β片）產(chǎn)生的纖維相比，所得纖維顯示出較低的β片含量（補(bǔ)充表2）。這可能反映了纖維在空氣中外部拉伸所產(chǎn)生的更大程度的機(jī)械變形，以及脫水效應(yīng)。為了支持拉曼結(jié)果，廣角X射線散射（WAXS）結(jié)果表明，通過不同紡絲方法形成的MaSp2纖維中β片納米晶體的含量具有相同的趨勢(shì)（補(bǔ)充圖6）。峰（020）歸一化后，峰（010）處的強(qiáng)度表明，手工拉絲纖維的相對(duì)結(jié)晶度與重復(fù)域內(nèi)聚丙氨酸塊數(shù)呈正相關(guān)。在沒有聚丙氨酸塊的情況下，充分手工拉絲制備的N-R12-C（xA）纖維的結(jié)晶度仍低于微流控紡絲制備的N-R12-C纖維。無(wú)論如何，這些結(jié)果表明，通過將水紡方法與機(jī)械后處理步驟相結(jié)合，可以進(jìn)一步微調(diào)仿生絲的性能。

為了闡明MaSp2光纖組裝機(jī)理，我們對(duì)器件運(yùn)行過程中組件的分布和物理力的相互作用進(jìn)行了數(shù)值模擬。在建模之前，進(jìn)行了流變學(xué)實(shí)驗(yàn)，以探測(cè)濃度為5至150 mg/ml的N-R12-C溶液的粘彈性（圖4a，b）。與其他重組 （NT2RepCT） 和天然螺旋體蛋白 36,37 的報(bào)告結(jié)果一致，N-R12-C 溶液表現(xiàn)出典型的剪切稀化行為，隨著剪切速率的增加，粘度降低。在25 °C下剪切速率為1 s?1時(shí)，天然螺桿菌的剪切粘度約為103 Pa s，遠(yuǎn)高于N-R12-C（均低于10 Pa s）和NT2RepCT（均低于1 Pa s）。與重組螺旋體相比，天然螺旋體蛋白的濃度和分子量要高得多，因此可以解釋這種顯著差異。為了直接比較相同濃度（如100 mg/ml）下重組螺旋體之間的剪切粘度，N-R12-C表現(xiàn)出明顯更高的剪切粘度（~2 Pa s），比NT2RepCT報(bào)告的剪切粘度（0.05–0.1 Pa s）高20倍以上，這可能歸因于重復(fù)單元的數(shù)量不同（12次重復(fù)與2次重復(fù)）。在這項(xiàng)工作中，發(fā)現(xiàn)重復(fù)區(qū)域中的丙氨酸殘基對(duì)螺旋體的粘度有顯著貢獻(xiàn)，與N-R12-C相比，N-R12-C（xA）的粘度較低。

剪切稀化機(jī)理尚不完全清楚，基于膠體和聚合物體系提出了兩種理論38,39。在膠體系統(tǒng)中，流動(dòng)過程中的相分離導(dǎo)致了剪切變薄行為，這種現(xiàn)象歸因于聚合物系統(tǒng)中分子鏈的解開。由于N-R12-C是一種生物聚合物，可以剪切以誘導(dǎo)相分離，因此其剪切稀化行為非常符合這兩種理論。使用Carreau模型擬合不同濃度下的粘度-剪切速率曲線，建立了非牛頓三維模型。通過這種方式，模擬了各種離子（檸檬酸鹽、磷酸鹽、氯離子和鈉離子）、蛋白質(zhì)濃度、剪切和伸長(zhǎng)率/應(yīng)力沿通道的分布。

在器件內(nèi)部產(chǎn)生的物理力方面，正如設(shè)計(jì)所預(yù)期的那樣，器件內(nèi)的伸長(zhǎng)流效應(yīng)被最小化，A和C部分的非收斂通道中的值可以忽略不計(jì)（補(bǔ)充圖9）。由于交叉幾何形狀，在A和B截面之間的閾值區(qū)域，材料蛋白質(zhì)可能會(huì)施加一定的伸長(zhǎng)應(yīng)力，但在確認(rèn)局部剪切應(yīng)力比伸長(zhǎng)應(yīng)力高9倍以上后，我們認(rèn)為其影響微不足道。

另一方面，剪切效應(yīng)在整個(gè)通道的纖維組裝過程中發(fā)揮了主導(dǎo)作用，從A段到C段的剪切富集區(qū)域（圖4c）和MaSp2（圖2a，b）的共定位一致，與比壓相對(duì)應(yīng)，我們的模型有效地預(yù)測(cè)了通道內(nèi)剪切應(yīng)力/速率的分布和值（圖4d，e和補(bǔ)充圖10）。如上所述，?60 kPa是微流控內(nèi)部蠶絲纖維組裝所需的臨界壓力，相當(dāng)于72 Pa和52282 s?1的閾值剪切應(yīng)力和速率。值得注意的是，MaSp2組裝所需的估計(jì)剪切速率（52282 s?1）比天然螺旋體（1500–3500 s?1）40,41的報(bào)道高一個(gè)數(shù)量級(jí)。這一結(jié)果可以通過重組和天然螺旋蛋白在濃度、粘度和分子量（重復(fù)域長(zhǎng)度）方面的差異以及計(jì)算建模中定義的旋轉(zhuǎn)和邊界條件來(lái)解釋。僅觀察到具有至少 12 個(gè)聚丙氨酸塊的三域 MaSp2 纖維出現(xiàn)剪切誘導(dǎo)的 β 片，并且 N-R12-C 纖維內(nèi)的 β 片含量估計(jì)在 18% 至 29% 之間，這是通過將剪切應(yīng)力從 72 Pa 變化到 111 Pa 來(lái)調(diào)節(jié)的（圖 4f）。顯然，通過使用剪切流的分子動(dòng)力學(xué)模擬，具有至少 6 個(gè)聚丙氨酸塊且沒有 CTD 和 NTD 的 MaSp1 纖維能夠在高達(dá) 300–700 MPa42 的剪切應(yīng)力下形成富含β片的結(jié)構(gòu)。

LLPS是蠶絲組裝過程中的第一步，對(duì)于負(fù)責(zé)分層組織的納米纖維化至關(guān)重要（補(bǔ)充討論）。與我們之前的研究一致12，必須需要完整的結(jié)構(gòu)域才能實(shí)現(xiàn) LLPS 和納米纖顫以形成 MaSp2 纖維。迄今為止，驅(qū)動(dòng)LLPS的潛在機(jī)制在很大程度上仍然未知。正如最近報(bào)道的那樣，Tyr和Arg殘基的功能類似于分子“粘物”，通過LLPS誘導(dǎo)螺旋體的相分離。在這項(xiàng)工作中，通過觀察 N-R12-C（xA） 對(duì) kosmotropic 陰離子觸發(fā)的自發(fā)反應(yīng)，Ala 殘基，特別是串聯(lián)形式（即聚丙氨酸塊）被確認(rèn)為影響 LLPS 的無(wú)關(guān)因素。同樣，在N-R12-C（xA）纖維中，沒有聚丙氨酸塊，宏觀上無(wú)法區(qū)分的分層結(jié)構(gòu)，因此沒有看到納米纖維顫動(dòng)受到抑制（圖5a）。

在沒有使用成熟的液晶和膠束理論的情況下，LLPS被當(dāng)作一個(gè)范式，以適當(dāng)?shù)乩斫馕覀兎律徑z系統(tǒng)中的絲自組裝過程（補(bǔ)充討論）。將天然樣觸發(fā)器依次引入微流體通道以產(chǎn)生離子和 pH 梯度，從而將 MaSp2 誘導(dǎo)到含有固體納米纖維的纖維中（圖 5b）。化學(xué)和物理觸發(fā)因素都是必需的，并且協(xié)同作用于纖維的形成，但后者在二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變中起著主導(dǎo)作用。應(yīng)用微流控系統(tǒng)來(lái)控制剪切是靈活的，這在這項(xiàng)工作中得到了強(qiáng)調(diào)，以研究其對(duì)結(jié)晶的影響。通過調(diào)節(jié)剪切應(yīng)力，有望制造出具有微妙調(diào)諧的β片結(jié)構(gòu)的人造絲纖維。

綜上所述，通過使用微流控裝置，我們報(bào)道了一種仿生策略，用于探測(cè)從LLPS到納米纖維化再到分層組織纖維的天然組裝過程中的β片發(fā)展。本工作為仿生紡紗在域結(jié)構(gòu)、微流控制備、剪切閾值和層次重構(gòu)方面的合理設(shè)計(jì)提供了依據(jù)。未來(lái)的工作將集中在研究仿生紡紗條件下組合的 MaSp1 和 MaSp2 螺旋體的絲組裝。將全面評(píng)估CTD和/或NTD形成的異二聚化，以更好地了解天然紡絲過程中螺旋體之間的相互作用。此外，基因序列中的特定氨基酸殘基將被編輯/取代，以探索LLPS的潛在機(jī)制。

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