1.3 流體控制

芯片色譜是以微流控芯片作為載體的色譜系統(tǒng),其核心-微流控芯片的關(guān)鍵功能就在于流體控制。高效的微流體控制是芯片色譜正常工作的基礎(chǔ)。進(jìn)樣是色譜分析極為重要的一個(gè)步驟。進(jìn)樣量過(guò)大會(huì)導(dǎo)致進(jìn)樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、色譜柱過(guò)載、峰展寬等問(wèn)題,嚴(yán)重影響色譜分離的效率。目前與高效液相色譜配套的進(jìn)樣針的規(guī)格普遍在微升級(jí)別,而芯片色譜平臺(tái)需要控制納升級(jí)別的進(jìn)樣量。因此,開(kāi)發(fā)與芯片色譜相匹配的進(jìn)樣系統(tǒng)顯得十分重要。芯片色譜進(jìn)樣技術(shù)大致可分為電動(dòng)進(jìn)樣與壓力進(jìn)樣兩類。其中,電動(dòng)進(jìn)樣無(wú)需泵閥結(jié)構(gòu)、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)使其成為最早投入使用的方法(T型和雙T型電動(dòng)進(jìn)樣通道),同時(shí)也是目前最常用的芯片色譜進(jìn)樣模式。Cong等開(kāi)發(fā)了一種電動(dòng)閥門式的芯片色譜進(jìn)樣結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖3a)。這種結(jié)構(gòu)中有一個(gè)電驅(qū)動(dòng)的可變型閥門,閥門兩側(cè)分別是進(jìn)樣通道和色譜柱。在準(zhǔn)備階段,在樣品通道與色譜通道兩端施加電壓,樣品先進(jìn)入樣品通道,并由于閥門阻擋無(wú)法進(jìn)入色譜柱。在進(jìn)樣階段,閥門脈沖開(kāi)關(guān)打開(kāi),樣品定量進(jìn)入色譜通道,之后閥門關(guān)閉并開(kāi)始色譜分離。電動(dòng)進(jìn)樣由于擴(kuò)散、遷移率等問(wèn)題,通常進(jìn)樣誤差很大,很難做到定量進(jìn)樣。相對(duì)的,基于機(jī)械手段推動(dòng)樣品的壓力進(jìn)樣方式可以實(shí)現(xiàn)高精度的定量進(jìn)樣。但由于需要對(duì)流體額外施加壓力,壓力進(jìn)樣需要更多泵閥結(jié)構(gòu)提供支持。壓力進(jìn)樣也可以通過(guò)分流的操作方式擺脫泵閥結(jié)構(gòu),從而實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單的定量進(jìn)樣。Gáspár等在PDMS芯片上設(shè)計(jì)了一種分流進(jìn)樣結(jié)構(gòu),由進(jìn)樣口注入分流區(qū)的樣品會(huì)依據(jù)分流結(jié)構(gòu)各通道的寬度比進(jìn)行分流。通過(guò)控制進(jìn)入色譜柱的通道與其他分流通道的比例就可以將進(jìn)樣量精確地控制在納升級(jí)。但需要指出,分流式壓力進(jìn)樣需要較大的樣品量,且不可避免地會(huì)造成樣品浪費(fèi)。Ha等開(kāi)發(fā)了一種特殊的“穿刺”進(jìn)樣方法,他們直接將微升級(jí)的進(jìn)樣針扎入PDMS芯片的通道中,之后用千分尺調(diào)節(jié)進(jìn)樣針筒活塞位置實(shí)現(xiàn)“穿刺進(jìn)樣”。由于千分尺精確的距離調(diào)節(jié),這種進(jìn)樣方式可實(shí)現(xiàn)3 nL體積的精準(zhǔn)可重復(fù)進(jìn)樣,且非常廉價(jià)、使用簡(jiǎn)單。

圖 3   芯片色譜流體控制措施

芯片色譜泵可簡(jiǎn)單分為芯片外置泵和芯片內(nèi)置泵。早期芯片色譜泵直接沿用高效液相色譜設(shè)備使用的常規(guī)高壓泵。但由于芯片通道尺寸減小,這些常規(guī)泵在進(jìn)行梯度分離時(shí)會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的梯度滯后現(xiàn)象。因此,常規(guī)泵需要加入分流裝置來(lái)調(diào)整流速,以適應(yīng)芯片色譜的工作條件。但分流在梯度分離中會(huì)造成嚴(yán)重的溶劑浪費(fèi),因此芯片色譜需要與其匹配的低流速高壓泵系統(tǒng)。在芯片外置泵中,能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)低流速和高壓力的最簡(jiǎn)單的泵類型就是注射泵。Grinias等通過(guò)閥門切換梯度儲(chǔ)存流路與UPLC泵和氣動(dòng)放大泵的連接實(shí)現(xiàn)了一種高壓注射泵結(jié)構(gòu)。在準(zhǔn)備階段,常規(guī)UPLC泵與梯度儲(chǔ)存流路相連,配制好的流動(dòng)相被注入梯度儲(chǔ)存流路并保存在其中。在色譜分離階段,切換閥門使裝載有流動(dòng)相的梯度儲(chǔ)存流路與色譜柱相連,啟動(dòng)與梯度儲(chǔ)存流路相連的氣動(dòng)泵,使儲(chǔ)存的流動(dòng)相以一個(gè)較高的壓力注入色譜柱中完成分離。這一泵結(jié)構(gòu)可以達(dá)到300 MPa的運(yùn)行壓力。芯片內(nèi)置泵的驅(qū)動(dòng)方式以電驅(qū)動(dòng)、電滲流和磁驅(qū)動(dòng)為主,雖然也存在芯片內(nèi)置機(jī)械泵,但蠕動(dòng)泵、氣動(dòng)泵結(jié)構(gòu)在芯片上的加工難度較高,應(yīng)用實(shí)例很少。最具代表性的芯片內(nèi)置泵是電滲泵(electroosmotic pumps, EOP)。EOP有如下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì):

(1) 可直接集成到微流控芯片上;

(2) 可生成無(wú)脈沖液流;

(3) 可快速改變液流大小和方向;

(4) 沒(méi)有運(yùn)動(dòng)組件,可有效提高泵的穩(wěn)定性和壽命;

(5) 在較大的背壓范圍內(nèi)都可產(chǎn)生中低流速液流。

Wang等開(kāi)發(fā)了一種高壓EOP芯片,該芯片泵的工作壓力約17 MPa,工作流速約為500 nL/min,該條件已足以支持芯片液相色譜的運(yùn)行。該芯片由大量EOP基本單元組成,每個(gè)EOP基本單元由數(shù)個(gè)電滲通道并聯(lián)而成。每個(gè)基本單元再與其他單元串聯(lián)成整個(gè)EOP芯片,芯片泵可產(chǎn)生的液流壓力直接正比于芯片內(nèi)含的EOP基本單元數(shù)量。

液滴技術(shù)作為一種新型的微流體控制技術(shù)也被應(yīng)用到了芯片色譜上。Gerhardt等將液滴微流控技術(shù)與HPLC芯片無(wú)縫組合(見(jiàn)圖3b),在HPLC芯片色譜柱出口處耦合T型液滴生成通道。利用與色譜通道正交的油相切割水相色譜洗脫物,將洗脫物以45 Hz的頻率切割為大量體積約1 nL的液滴。靜態(tài)液滴內(nèi)流體為層流狀態(tài),具有低擴(kuò)散、無(wú)返混的特點(diǎn)。因此將色譜洗脫物切割為液滴的過(guò)程,相當(dāng)于將色譜分離的色譜圖譜切割成大量片段并進(jìn)行保存,防止洗脫物返混合污染,最大限度地保留了分離分辨率。這一利用液滴保存色譜結(jié)果的技術(shù)也為洗脫物在柱后進(jìn)一步的處理與分析提供了時(shí)間和空間條件。

1.4 檢測(cè)器

相較于常規(guī)色譜,芯片色譜需要更加靈敏、響應(yīng)更快的檢測(cè)器。芯片色譜常用的檢測(cè)器可分為光學(xué)檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器3類。紫外-可見(jiàn)光譜法是分析化學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的光學(xué)檢測(cè)手段,其簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)使其在芯片色譜中有著廣泛的應(yīng)用。但芯片通道尺寸相較常規(guī)色譜柱徑的大幅度縮小,使得芯片色譜通道的光程大幅縮小。這極大影響了紫外-可見(jiàn)光譜在芯片色譜上原位檢測(cè)的靈敏度(尤其是當(dāng)通道寬度小于100 μm時(shí))。因此,在芯片色譜上進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜檢測(cè)需要通過(guò)增大通道寬度或添加微結(jié)構(gòu)(如光纖、波導(dǎo)管)等手段來(lái)增加光程,以提高檢測(cè)靈敏度。相比之下,熒光光譜的發(fā)射光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正相關(guān),在使用激光這樣的強(qiáng)光源作為激發(fā)光源時(shí)(激光誘導(dǎo)熒光光譜,LIF),光程的減小對(duì)熒光光譜檢測(cè)靈敏度的影響幾乎可以忽略。熒光光譜主要局限于可自發(fā)熒光的物種有限,目前需要借助熒光標(biāo)記和熒光染料才能做到廣泛應(yīng)用。TPE熒光光譜利用兩個(gè)光子同時(shí)激發(fā)一個(gè)分子,可使分子達(dá)到更高的能級(jí),從而讓一些原本不會(huì)發(fā)出熒光的分子產(chǎn)生熒光信號(hào),該技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記的廣泛熒光檢測(cè)。Hackl等將電色譜芯片與TPE熒光光譜聯(lián)用(見(jiàn)圖4a),實(shí)現(xiàn)了芯片色譜平臺(tái)上的無(wú)標(biāo)記時(shí)間分辨熒光光譜檢測(cè)。該芯片對(duì)多環(huán)芳烴的檢測(cè)靈敏度達(dá)到了nmol級(jí)。他們同時(shí)還證明了532 nm的TPE熒光光譜可以達(dá)到與266 nm單光子激發(fā)(one-photon excitation, OPE)熒光光譜相近的靈敏度。這意味著雙光子激發(fā)熒光光譜可在聚合物芯片等具有一定紫外吸收能力、但更容易制作的芯片平臺(tái)上使用,而無(wú)標(biāo)記單光子激發(fā)熒光光譜則需要使用石英等低紫外吸收的芯片材料來(lái)保證檢測(cè)靈敏度。除了紫外-可見(jiàn)光譜、熒光光譜外,拉曼光譜、表面增強(qiáng)拉曼光譜也被嘗試應(yīng)用于芯片色譜檢測(cè)器,并表現(xiàn)出可期的前景。

電化學(xué)檢測(cè)器是通過(guò)檢測(cè)電極表面電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的電信號(hào)(電流、電壓)來(lái)進(jìn)行分析檢測(cè)的手段。用于電化學(xué)檢測(cè)的電極可以很容易地進(jìn)行微型化,并集成到微流控芯片平臺(tái)上。而且,電化學(xué)檢測(cè)的工作站已經(jīng)可以做到小型化便攜式,因此電化學(xué)檢測(cè)方法也被視為實(shí)現(xiàn)便攜式芯片色譜的重要手段。電化學(xué)檢測(cè)方法在芯片色譜中的應(yīng)用有一個(gè)限制因素:電極的使用壽命有限,需要經(jīng)常更換;常見(jiàn)的微流控芯片在封裝后就無(wú)法再拆開(kāi),因此電極損壞后檢測(cè)芯片就只能報(bào)廢處理。Erkal等為解決這一問(wèn)題,開(kāi)發(fā)了一種3D打印的電化學(xué)檢測(cè)芯片。這種芯片在電極位置加工了螺紋結(jié)構(gòu)用于可替換電極的固定;同時(shí)螺紋結(jié)構(gòu)還滿足了芯片的密封需求,使得芯片多次更換電極也不會(huì)漏液。相比于常規(guī)電導(dǎo)、電勢(shì)檢測(cè)需要的電極與溶液直接接觸,電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)(capacitively coupled contactless conductivity detection, C4D)不需要與待測(cè)溶液直接接觸,且電導(dǎo)檢測(cè)靈敏度極高,其作為微流控芯片檢測(cè)器更具潛力。Beutner等設(shè)計(jì)了一種C4D與質(zhì)譜聯(lián)用的檢測(cè)方法,用于毛細(xì)管電泳分析檢測(cè)酚類物質(zhì)。他們發(fā)現(xiàn)這兩種檢測(cè)方法具有較好的互補(bǔ)性:C4D檢測(cè)器對(duì)間甲酚具有極佳的靈敏度而對(duì)硝基酚敏感性不佳,而質(zhì)譜檢測(cè)器則正好相反。

圖 4   部分芯片色譜檢測(cè)器

質(zhì)譜法是基于不同質(zhì)荷比的離子在電場(chǎng)加速后進(jìn)入磁場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)軌跡的不同,或在真空中飛行時(shí)間的不同,進(jìn)行物質(zhì)鑒定的檢測(cè)方法。質(zhì)譜法的質(zhì)量分辨本領(lǐng)使其具有極高的靈敏度和分辨率,以及超快的分析速度,同時(shí)還能提供豐富的分析信息。相比于光學(xué)檢測(cè)器和電化學(xué)檢測(cè)器,質(zhì)譜檢測(cè)器顯然是三者之中結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜,成本最為昂貴的檢測(cè)器。但由于質(zhì)譜法極高的靈敏度、微型化色譜與質(zhì)譜極好的相容性以及質(zhì)譜在組學(xué)研究中的重要地位,芯片色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用仍然是前沿的研究方向。芯片色譜與質(zhì)譜聯(lián)用需要解決色譜出口與質(zhì)譜離子源之間的耦合問(wèn)題。目前常用的芯片色譜-質(zhì)譜聯(lián)用離子源是ESI和基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源。ESI離子源因其廣泛的應(yīng)用性和高靈敏度而成為與芯片色譜耦合最理想的離子源。Lotter等對(duì)玻璃芯片的ESI噴口進(jìn)行了較為系統(tǒng)的探究。他們研究了4類ESI噴口形狀對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)效果的影響(見(jiàn)圖4b),發(fā)現(xiàn)在高流速(約400 nL/min)條件下4種芯片噴口沒(méi)有明顯的區(qū)別。但是在低流速(<50 nL/min)條件下,尖銳的ESI噴口(pulled和ground型)產(chǎn)生的電噴霧更加穩(wěn)定,離子化效果更好。加工芯片ESI噴口需要較為精密的加工技術(shù),一種更為簡(jiǎn)單的噴口構(gòu)建方法是在芯片柱上嵌入一段拉尖毛細(xì)管作為ESI噴口。Dietze等在制作聚合物芯片時(shí),在通道中嵌入一段一端燒蝕拉尖的毛細(xì)管,成功與ESI源耦合。這種利用毛細(xì)管針尖制作噴口的方法特別適合于聚合物這類無(wú)法直接作為ESI噴嘴的芯片基底材料。MALDI離子源應(yīng)用于微流控芯片上,可分為在線離子源和離線離子源兩類。人們已報(bào)道了數(shù)類微流控MALDI芯片,但帶有色譜分離功能的芯片色譜-MALDI-MS較少。Lazar等開(kāi)發(fā)了一種新型的液相色譜-MALDI-MS芯片(見(jiàn)圖4c),該芯片以C18顆粒填料作為色譜固定相,在色譜柱通道的正交方向制作了大量與色譜柱通道相通的MALDI收集通道。在進(jìn)樣并完成色譜分離后,洗脫物不再由色譜柱軸向洗脫,而是通過(guò)與MALDI收集通道相連的電滲泵結(jié)構(gòu)橫向泵入MALDI儲(chǔ)液槽中,直接進(jìn)行MALDI-MS檢測(cè)。由于MALDI收集通道被集成在色譜柱通道側(cè)向,進(jìn)行洗脫物收集時(shí)相當(dāng)于對(duì)色譜圖進(jìn)行了切割和分段檢測(cè),這使得該系統(tǒng)可以獲得優(yōu)良的分辨率和檢測(cè)通量。

3 總結(jié)與展望

從歷史上第一個(gè)芯片色譜裝置誕生至今已近30年,但芯片色譜技術(shù)仍基本停留在基礎(chǔ)研究和科研實(shí)驗(yàn)室里。相較于最初的期待,芯片色譜走向產(chǎn)業(yè)化的推進(jìn)速度顯得些許緩慢。目前存在的主要瓶頸在于:芯片色譜技術(shù)對(duì)微型化、集成化的需求與芯片材料、工藝和設(shè)計(jì)發(fā)展現(xiàn)狀的矛盾。微流控芯片微型化、集成化主要通過(guò)縮小通道尺寸和增加通道總長(zhǎng)度實(shí)現(xiàn)。對(duì)微納尺度流體,通道尺寸的縮小和長(zhǎng)度的增加都會(huì)大幅增加流體阻力?，F(xiàn)有的芯片基底材料承壓能力普遍在60 MPa以下,材料性質(zhì)限制了色譜芯片微型化和集成化的進(jìn)一步提升。這一瓶頸的解決在于發(fā)展新型的芯片基底材料,尤其是高強(qiáng)度和優(yōu)良加工性的聚合物材料;同時(shí)也需要產(chǎn)業(yè)界形成相對(duì)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的流體通道基本結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì),以提高材料性能的利用度。此外,與芯片色譜匹配的外部設(shè)備微型化程度低,芯片接口技術(shù)尚不成熟,以及芯片色譜產(chǎn)業(yè)缺乏統(tǒng)一行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等,都有待學(xué)術(shù)界與產(chǎn)業(yè)界共同努力解決。但客觀地看,色譜微型化的趨勢(shì)已經(jīng)十分明顯:毛細(xì)管色譜的產(chǎn)業(yè)化、微流甚至納流色譜的推廣及其在生物醫(yī)學(xué)分析中應(yīng)用已日漸增多。作為色譜微型化另一途徑的芯片色譜,正式走向?qū)嶋H應(yīng)用只是時(shí)間問(wèn)題。芯片液相色譜極高的可擴(kuò)展性、可集成性以及模塊化的優(yōu)勢(shì)使其最有可能成為色譜這項(xiàng)技術(shù)走入便攜檢測(cè)(POCT)領(lǐng)域的方式,但這一理想還有待進(jìn)一步提高芯片集成度和系統(tǒng)微型化程度才能真正實(shí)現(xiàn)。相信在不久的將來(lái),“plug-and-play”的芯片色譜將成為現(xiàn)實(shí)。

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