摘 要 現(xiàn)有細菌定量檢測多依賴專業(yè)實驗室,檢測周期較長。 針對此問題,本研究基于微流控芯片液滴數(shù)字化分析,建立了一種細菌定量檢測方法。 采用具有平行液滴分析單元的微流控芯片,其特點在于使用了注射器真空驅(qū)動液滴產(chǎn)生方法。 借助刃天青顯色反應(yīng)引起的熒光強度改變,可指示液滴內(nèi)活性細菌的存在。 通過計算細菌陽性液滴的比例,采用泊松分布算法,計算出原始樣品中的細菌密度。 實驗結(jié)果表明,本方法可在3. 5 h 內(nèi)完成細菌定量分析,動態(tài)檢測范圍為 105~ 108 CFU/ mL,相對標準偏差(RSD)低于5% 。 本方法具有操作簡便和分析速度快的優(yōu)勢,有望廣泛用于細菌快速定量檢測。

細菌定量檢測對于食品安全、環(huán)境監(jiān)測和疾病診斷均具有重要作用。 由于細菌定量檢測經(jīng)常在資源有限的情況下進行,而且對于檢測時間要求很高,因此需要簡便快速的檢測方法。 目前,用于細菌定量檢測的方法主要包括培養(yǎng)計數(shù)法、熒光定量分析 PCR、流式細胞術(shù)等,以及一些基于新型生物傳感器的檢測方法。 這些技術(shù)仍存在一定的局限性,如檢測周期較長、操作步驟繁瑣、依賴于大型設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員。 因此,迫切需要建立操作簡便、分析快速的細菌定量檢測方法。

液滴數(shù)字化分析是近年發(fā)展起來的一種高精度定量分析方法。 液滴數(shù)字化分析的原理是利用液滴技術(shù)將待測靶標隨機分配到大量相互獨立的微滴中,每個液滴中最多含有一個靶細胞,每個微滴相當于一個獨立的微反應(yīng)器; 繼而針對待測靶標在微液滴中的直接或間接信號,區(qū)分陽性和陰性液滴。 陽性微滴判讀為 1,陰性微滴判讀為 0,可根據(jù)泊松分布原理進行計算,實現(xiàn)待測靶標的絕對定量分析。 與傳統(tǒng)的分析技術(shù)相比,液滴數(shù)字化分析最突出的特點是其具有不依賴標準品的絕對定量分析能力。 此外,基于大規(guī)模液滴分散體系的數(shù)字化分析在檢測靈敏度和定量分析精度等方面也顯著優(yōu)于傳統(tǒng)定量分析方法。 鑒于微流控技術(shù)是大規(guī)模液滴操控的有利工具,微流控芯片成為數(shù)字化液滴分析的主要平臺。

自液滴數(shù)字化分析提出以來,此技術(shù)被廣泛用于多種類型的定量生物分析中, 包括核酸、蛋白和細胞分析,以及數(shù)字化細菌分析。 得益于微液滴對于反應(yīng)信號的相對富集作用,以及數(shù)字化分析方法的高檢測精度,數(shù)字化細菌分析在分析時間和定量分析精度等方面均顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的細菌定量分析。 Boedicker 等利用阿爾瑪藍指示細菌活性,結(jié)合液滴數(shù)字化分析技術(shù),最快可在 2 h 內(nèi)檢測出樣品中的活性細菌,并且能夠在 7 h 內(nèi)獲得細菌的耐藥性信息。 Kang 等結(jié)合 DNA 酶傳感器與液滴數(shù)字化分析技術(shù),能夠在 3 h 內(nèi)得到血液樣品中的細菌定量分析信息,其實際密度與理論值的相關(guān)性良好(R2= 0. 999),測定下限達到 1 CFU/ mL。 Kaushik 等結(jié)合刃天青顯色原理與液滴數(shù)字化分析技術(shù),將細菌與顯色體系限制在約 20 pL 的液滴中,能夠在1 h內(nèi)得到細菌的耐藥性信息。Scheler等用含綠色熒光蛋白的大腸桿菌驗證了液滴數(shù)字化分析的定量分析能力,與平板計數(shù)法結(jié)果的相關(guān)性良好(R2= 0. 9964),結(jié)合刃天青顯色法原理,在 3 ~ 4 h 得到樣品中細菌的耐藥性信息。

液滴數(shù)字化分析不依賴標準品的絕對定量分析能力,以及在靈敏度和定量分析精度方面的優(yōu)勢,非常有利于現(xiàn)場快速細菌檢測,然而,此技術(shù)在該領(lǐng)域的應(yīng)用還鮮有報道。 其主要原因在于微流控芯片上的液滴發(fā)生多依賴基于氣壓或注射泵等流體驅(qū)動裝置, 這類裝置體積較大且操作繁瑣,難以應(yīng)用于現(xiàn)場快速檢測。 相比較而言,正壓驅(qū)動液滴發(fā)生方式使用廣泛,文獻已經(jīng)報導(dǎo)了基于負壓的液滴發(fā)生方法。 在負壓驅(qū)動的液滴發(fā)生體系中,僅需要一個簡單的注射器即可驅(qū)動油水兩相液體流動,并發(fā)生液滴。 這種液滴發(fā)生方法操作簡便,無需復(fù)雜結(jié)構(gòu)流體控制設(shè)備,因而有望將液滴數(shù)字化細菌分析拓展到現(xiàn)場快速檢測領(lǐng)域。

微流控芯片技術(shù)在生物樣品分析中得到廣泛的應(yīng)用。 本研究基于負壓驅(qū)動液滴微流控芯片,建立了一種細菌定量檢測方法。 采用具有平行液滴分析單元的微流控芯片,其特點在于使用了注射器真空驅(qū)動的流動聚焦式液滴發(fā)生方法。 利用單個注射器,即可實現(xiàn)多個分析單元中的快速平行液滴發(fā)生和捕獲。 以大腸桿菌為模式分析對象,借助刃天青顯色反應(yīng),實現(xiàn)數(shù)字化液滴細菌定量分析。 依據(jù)顯色反應(yīng)陽性液滴的比例,使用泊松分布原理計算原始樣品中的大腸桿菌密度。 實驗結(jié)果表明,本方法具有操作簡便和分析速度快的優(yōu)勢,有望用于細菌的現(xiàn)場快速定量檢測。

微流控芯片

微流控芯片包含具有圖形化結(jié)構(gòu)的PDMS頂層和無結(jié)構(gòu)的玻璃底層(圖 1)。PDMS 層包含一組6個輻射狀排列分析單元,匯聚于同一出口,即負壓施加點。 每個單元包括上游的液滴發(fā)生器以及下游的液滴儲存池。 PDMS層使用標準光刻-倒模工藝加工,等離子處理后,與玻璃底層封接。加工完成的芯片經(jīng)紫外線照射 1 h,并于使用之前保存 1周。與芯片連接的特氟龍毛細管經(jīng)高壓消毒后保存?zhèn)溆谩?/span>

圖1 微流控芯片示意圖

液滴數(shù)字化顯色分析 液滴數(shù)字化顯色分析流程如圖 2 所示,具體操作如下:(1)使用特氟龍毛細管將注射器與芯片出口連接,將樣品溶液和油相溶液分別加載到芯片的樣品池和油相池; (2)拉動注射器針柄,利用注射器真空產(chǎn)生的負壓驅(qū)動油相和水相溶液流動,引發(fā)液滴發(fā)生。

圖 2 微流控芯片液滴數(shù)字化細菌分析流程示意圖

注射器真空驅(qū)動的液滴發(fā)生

在注射器真空作用下,液滴分析單元的末端壓力接近于 0,而入口端液面壓力為 1 個大氣壓,這種壓力差存在于每個分析單元。 因此,利用一個注射器可實現(xiàn)多個分析單元內(nèi)的同步液滴發(fā)生。 在大氣壓驅(qū)動下,水相和油相共同進入芯片通道。 在十字型通道結(jié)構(gòu)液滴發(fā)生器處,油相剪切力作用于水相,因而將水相切割為液滴。 液滴的尺寸由液滴發(fā)生器處通道尺寸以及油相和水相的流速決定。 對于本實驗中,液滴發(fā)生器十字型通道的尺寸為:水相孔徑20 滋m,油相孔徑175μm,深度40μm。 在注射器真空驅(qū)動下,6個平行單元的液滴發(fā)生頻率介于 180 ~ 193 Hz 之間,生成的液滴可在 3 min內(nèi)充滿液滴收集池。 成像分析(圖3)顯示,收集池內(nèi)液滴變化范圍介于 25. 69 ~ 33. 01μm 之間,每個單元內(nèi)的液滴體積相對標準偏差(RSD)<2% ,均符合正態(tài)分布(p>0. 05)。 由此可見,這種注射器真空驅(qū)動發(fā)生的液滴均一性較好,滿足數(shù)字化分析要求。 不同分析單元的液滴體積偏差的原因是單元內(nèi)流動阻力的細微差異造成的流速差異。 由于液滴數(shù)字化分析引入了體積校正,不同單元內(nèi)液滴體積的偏差并不影響定量分析結(jié)果。

液滴反應(yīng)體系的穩(wěn)定性

PDMS 材質(zhì)芯片在長時間培養(yǎng)中存在水分遷移問題。 如圖 4 所示,原生 PDMS 芯片中的液滴在連續(xù)培養(yǎng)中體積持續(xù)降低,3 h 內(nèi)液滴體積可減少 95% 以上,提示存在水相-油相鄄PDMS 的水蒸汽遷移途徑。本研究從兩個方面采取措施,有效控制水分遷移問題:一是芯片底層采用密閉的玻璃材料,部分降低蒸發(fā)效應(yīng); 二是在PDMS頂層覆蓋礦物油,降低蒸發(fā)。 如圖 4 所示,在優(yōu)化的芯片反應(yīng)條件下,37℃ 孵育3 h 后,液滴體積只降低了13. 54%依 5. 65% ; 孵育 6 h 后,液滴體積也只降低了20. 79%依4. 68% 。

實驗中還發(fā)現(xiàn)了油鄄水界面成分串擾問題。 在使用7500氟化油、十六烷和石蠟油的液滴體系中,均發(fā)現(xiàn)細菌穿梭于油鄄水界面(圖 5)以及液滴內(nèi)刃天青的油相擴散(圖6),明顯影響了液滴顯色實驗的穩(wěn)定性和靈敏度。這些現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于油-水界面的屏蔽作用不足。本研究通過調(diào)整表面活性劑濃度改善液滴穩(wěn)定性。 結(jié)果表明,即使增加表面活性劑濃度,也不能完全消除7500氟化油、十六烷液滴體系存在的成分串擾,但添加3% ABIL EM90 的石蠟油則可完全杜絕此問題。這是因為外表面活性劑增強了油-水界面的穩(wěn)定性,同時石蠟油具有較高的粘度,遏制了細菌游出。

圖 3  6個單元內(nèi)液滴的體積分布圖

液滴內(nèi)的細菌指示顯色反應(yīng)

液滴細菌顯色反應(yīng)以刃天為指示劑。 刃天青指示細菌活性的原理是:在活性細菌的多種還原酶作用下,無熒光的刃天青轉(zhuǎn)變?yōu)橛袩晒獾脑圎u靈。 鑒于液滴內(nèi)細菌數(shù)量對于顯色反應(yīng)信號強度的影響,顯色反應(yīng)條件的優(yōu)化均使用單細菌分散體系。本研究借助Syto 9染色,確定了適宜的輸入細菌密度為1. 5*10⁶ CFU/ mL。在此輸入密度下,理論上,100%的液滴內(nèi)細菌數(shù)≤1,即每個液滴最多包裹1個細菌。

圖 4 優(yōu)化的芯片反應(yīng)條件抑制液滴內(nèi)水分遷移

測定了刃天青顯色信噪比相對孵育時間的變化,由圖 7A 可見,培養(yǎng) 2 h 后,開始出現(xiàn)顯著區(qū)別于噪聲的熒光(+)信號。 根據(jù)圖7A的結(jié)果分析培養(yǎng)5 h的陽性液滴數(shù)量穩(wěn)定時間,如圖7B所示,3. 5 h后,陽性液滴數(shù)不再增加,因此,后續(xù)實驗均采用3. 5 h作為反應(yīng)終點時間。 相較于傳統(tǒng)試管方法12 h左右的顯色反應(yīng)時間,液滴顯色反應(yīng)所需時間大幅縮短,這得益于液滴分散對于樣品和顯色信號的相對富集效應(yīng)。在液滴分散體系內(nèi)只有部分液滴內(nèi)包裹細菌,相應(yīng)地液滴顯色反應(yīng)結(jié)果表現(xiàn)為“全冶或“無冶的形式,而宏觀反應(yīng)體系呈現(xiàn)的是平均反應(yīng)強度。 對于包裹細菌的液滴,液滴內(nèi)細菌密度較宏觀體系提高。例如,直徑30μm的液滴中包含單個細菌情況下,液滴內(nèi)細菌密度約為 9*10⁶ CFU/ mL,其密度相對于 10⁶ CFU/ mL 密度的細菌懸液提升9倍,而相對于10⁵ CFU/ mL 的細菌懸液提升了90倍。 由于液滴的封閉效應(yīng),液滴內(nèi)的顯色信號快速蓄積,因而可在較短時間內(nèi)達到檢測限。 由于不同種類細菌存在代謝活性差異,這種液滴數(shù)字化顯色分析方法的普適性需要通過測試更多種類細菌進行驗證。

圖 5 不同油相條件下液滴的細菌屏蔽作用比較

為了驗證液滴刃天青顯色方法對于細菌的特異性指示效果,借助圖像指示,在1個液滴細菌分散體系內(nèi)隨機抽取100個不含菌的液滴和100個含活性菌液滴,使用非參數(shù)秩和檢驗分析了兩組液滴內(nèi)熒光強度的差異。 結(jié)果表明,兩組細菌的顯色信號具有顯著性差異( p<0. 05),提示液滴刃天青顯色法可特異性指示活性細菌。

建立了一種基于微流控液滴數(shù)字化顯色分析的細菌快速定量分析方法。 利用注射器真空發(fā)生液滴,操作簡便可靠; 芯片采用平行分析單元設(shè)計,可提供適宜的測試通量。 本方法定量分析精度高,定量分析RSD低于5% ; 分析時間短,可在3. 5 h內(nèi)獲得細菌定量分析信息。 上述特點使得這種細菌定量分析方法非常適用于資源有限條件下的細菌快速檢測。

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