摘要

腫瘤來(lái)源的循環(huán)外泌體 （TDE） 正在被作為信息和非侵入性生物標(biāo)志物。然而，定量檢測(cè)TDE仍然具有挑戰(zhàn)性。在此，我們構(gòu)建了DNA四面體結(jié)構(gòu)探針（TSP）介導(dǎo)的微流控磁檢測(cè)系統(tǒng)（μFMS），為分析TDEs提供了一個(gè)快速、靈敏的平臺(tái)。構(gòu)建CD63適配體修飾的Fe3O4磁性納米顆粒（MNPs）形成磁性納米報(bào)告探針（MNRs）。微流控芯片由DNA TSP修飾的醛基功能化的玻璃和蛇形微通道設(shè)計(jì)的PDMS層制成。模擬血清與PBS在TDE檢測(cè)方面無(wú)顯著差異，表明了所構(gòu)建的μFMS系統(tǒng)在復(fù)雜生物系統(tǒng)中進(jìn)行TDE分析的可行性。在成本、反應(yīng)時(shí)間和操作程序方面，該μFMS有潛力被開(kāi)發(fā)為癌癥診斷和治療的臨床即時(shí)檢測(cè)工具。

介紹

癌癥目前人類(lèi)的主要死因，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。外泌體是大多數(shù)癌細(xì)胞分泌的杯狀脂質(zhì)雙層膜囊泡（直徑 30-150 nm），含有生物活性脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)貨物。腫瘤來(lái)源的循環(huán)外泌體 （TDE） 通過(guò)癌細(xì)胞膜的向外膨脹釋放，并且可以通過(guò)傳遞不同的信號(hào)分子來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，參與癌癥中的各種生理和病理過(guò)程。越來(lái)越多的研究表明，組織和血清中有許多 TDE 可以被識(shí)別為早期診斷的癌癥生物標(biāo)志物。在 TDEs5 表面發(fā)現(xiàn)了多種膜蛋白，例如膜運(yùn)輸?shù)鞍祝≧abs、膜聯(lián)蛋白）、熱休克蛋白（Hsp 90、Hsp 70、Hsp60 和 Hsc70）和四跨膜蛋白（CD82、CD9、CD63、CD81）。其中，CD9 和 CD63 等四跨膜蛋白已被用作鑒定和分析 TDEs 的外泌體特異性標(biāo)記物。

迄今為止，通過(guò)識(shí)別和結(jié)合外泌體表面的四跨膜蛋白，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多 TDE 檢測(cè)方法，包括熒光 、比色法、ELISA、表面等離子體共振 （SPR）、表面增強(qiáng)拉曼散射 （SERS） 和電化學(xué)。然而，由于檢測(cè)性能相對(duì)較低、操作復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn)，這些方法尚未在臨床上得到應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)一個(gè)靈敏、快速、自動(dòng)化的TDE分析檢測(cè)平臺(tái)至關(guān)重要。、

最近，磁性生物傳感器已成為強(qiáng)大的分子分析診斷平臺(tái)，可測(cè)量包括 DNA、可溶性蛋白質(zhì)、外泌體和細(xì)胞在內(nèi)的靶標(biāo)，具有固有的低背景噪聲和生物介質(zhì)中穩(wěn)定的信號(hào)等優(yōu)勢(shì)。一般來(lái)說(shuō)，磁性納米材料（MNPs）、標(biāo)記策略和磁力計(jì)是用于分子分析的磁性生物傳感器的關(guān)鍵因素。MNP，包括鐵氧體 MNP、鐵芯 MNP 和多核 MNP，由于其獨(dú)特的磁性和易于表面改性的特點(diǎn)，是傳感應(yīng)用的有吸引力的材料。其中，鐵氧體MNPs因其高M(jìn)sat（飽和磁化強(qiáng)度）值、低毒性等特點(diǎn)，在磁性生物傳感器中得到更廣泛的應(yīng)用。粒徑是影響磁性生物傳感器檢測(cè)性能的因素之一，流體動(dòng)力學(xué)直徑小于 50 nm 的 MNP 已被證明是理想的尺寸。磁性生物傳感器的常見(jiàn)標(biāo)記策略包括聚類(lèi)測(cè)定、夾心測(cè)定和直接標(biāo)記。夾心磁標(biāo)記是使用親和配體功能化MNP捕獲生物靶標(biāo)的最廣泛使用的方法之一。親和配體與固定在固體基板表面的二級(jí)親和配體偶聯(lián)，將MNP帶到傳感器表面進(jìn)行磁信號(hào)檢測(cè)。親和配體（如適配體）可以識(shí)別具有高親和力和特異性的靶標(biāo)，已越來(lái)越多地用于與MNPs的偶聯(lián)。 各種類(lèi)型的磁力計(jì)已被應(yīng)用于測(cè)量用親和配體功能化MNP標(biāo)記的生物靶標(biāo)產(chǎn)生的磁信號(hào)，包括磁通門(mén)傳感器、超導(dǎo)量子干涉器件（SQUIDs）、光泵浦原子磁力計(jì)（OPM）、 磁阻 （MR） 傳感器、霍爾效應(yīng)磁力計(jì)和感應(yīng)線(xiàn)圈 。SQUID和OPM傳感器具有很高的檢測(cè)靈敏度，但它們?cè)谛⌒突徒档统杀痉矫娴臐摿τ邢?。磁通門(mén)傳感器、磁阻傳感器和霍爾傳感器已用于 POCT 檢測(cè)，但它們的檢測(cè)靈敏度有限?；诟袘?yīng)線(xiàn)圈的磁性探測(cè)器具有易于小型化、集成化和低成本的優(yōu)點(diǎn)。將感應(yīng)線(xiàn)圈與差分電路相結(jié)合，可以大大降低噪聲，提高磁探測(cè)器的靈敏度。例如，由感應(yīng)線(xiàn)圈和差分電路組成的磁性傳感器陣列能夠以高靈敏度對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行空間成像。

微流控芯片可以將實(shí)驗(yàn)室集成到單個(gè)芯片中，以實(shí)現(xiàn)快速和自動(dòng)檢測(cè)，通過(guò)提供高通量和靈敏度與低試劑消耗的有吸引力的組合，使檢測(cè)和分析 TDE 成為可能。用于TDE檢測(cè)的微流控芯片通常由上蓋和底層基板組成。為了提高捕獲效率，微觀結(jié)構(gòu)通常設(shè)計(jì)在上層通道中，以提供較大的表面積。下層通常用作固定親和配體的固體底物，例如抗體和適配體。

近年來(lái)，自組裝DNA納米技術(shù)因其非凡的生物穩(wěn)定性和生物相容性而備受關(guān)注。三維 DNA TSP 已被引入用于檢測(cè) DNA、microRNA、CTC 和 TDEs40。DNA TSPs通過(guò)共價(jià)結(jié)合，可以很容易地固定在固體底物上，具有優(yōu)異的可控性和高精度的取向，可以減少非特異性吸附，調(diào)節(jié)抗體和適配體等親和配體的分布和取向，從而提高檢測(cè)靈敏度。

在這項(xiàng)工作中，我們開(kāi)發(fā)了一種微流控磁檢測(cè)系統(tǒng)（μFMS），通過(guò)將MNP、微流控芯片和基于感應(yīng)線(xiàn)圈的磁探測(cè)器與DNA TSPs相結(jié)合，用于快速靈敏地檢測(cè)TDE。CD適配體修飾的 MNP 可以將捕獲 TDE 的事件轉(zhuǎn)換為磁信號(hào)，并以電壓信號(hào)的形式輸出。采用帶有差分放大電路的感應(yīng)線(xiàn)圈來(lái)消除大部分背景噪聲。DNA TSP被引入并固定在醛修飾的載玻片上（圖S3），作為支架形成TDEs的捕獲結(jié)構(gòu)。帶有蛇形微通道的PDMS上層與載玻片緊密結(jié)合，并與磁性檢測(cè)裝置集成。對(duì)μFMS進(jìn)行了研究和優(yōu)化，以自動(dòng)、靈敏和快速分析從U2細(xì)胞系中提取的TDE。

結(jié)果與討論

μFMS的工作原理

μFMS通過(guò)三明治樣免疫測(cè)定法檢測(cè)TDE。DNA TSP通過(guò)胺和醛基之間的共價(jià)偶聯(lián)固定在醛官能化載玻片上（圖1a）。將SA和生物素-抗CD9依次注射到微通道中，形成DNA TSPs/SA/生物素-抗CD9結(jié)構(gòu)。TDE和MNR溶液通過(guò)入口泵入微流控芯片。在流經(jīng)蛇形混合微通道時(shí)，兩種溶液混合并發(fā)生反應(yīng)。然后，DNA TSPs/SA/生物素-抗CD9捕獲結(jié)構(gòu)、TDEs和MNRs之間形成夾層結(jié)構(gòu)（圖1b）。之后，使用PBS沖洗MNR，然后將其收集到Eppendorf管中。由于我們使用的磁傳感平臺(tái)比在芯片上更能測(cè)量 MNR 產(chǎn)生的基于體積的磁信號(hào)，因此我們使用磁力計(jì)磁探測(cè)器測(cè)量了總 MNR（Voltage total MNRs）和沖洗后的 MNR（沖洗后的電壓 MNR）的電壓輸出信號(hào)。通過(guò)計(jì)算總電壓MNRs和沖洗后的電壓MNRs之間的差值，獲得了片上捕獲的TDEs（片上電壓MNR）的電壓輸出信號(hào)。

圖1

提取的 TDE 的表征

透射電鏡觀察從U251細(xì)胞系中提取的TDEs的形態(tài)。結(jié)果表明，TDEs具有典型的杯形膜結(jié)構(gòu)，平均尺寸為100 ~ 150 nm（圖2a），這與之前的報(bào)道一致。DLS結(jié)果表明，TDEs的平均尺寸在131 nm的峰值處（圖2b），證實(shí)了我們制備的樣品中存在TDE。WB 顯示了 CD63 和 CD9 標(biāo)記蛋白的透明條帶（圖 2c），這表明 CD63 和 CD9 在 TDE 表面表達(dá)。NTA分析的TDEs大小分布和濃度顯示，從U251細(xì)胞系中提取的TDEs濃度為1.98×1011顆粒/mL，平均大小為131 nm（圖2d），這與DLS結(jié)果一致，證實(shí)了我們制備的樣品中存在TDEs，可用于進(jìn)一步研究。

圖2

DNA TSP 和 MNR 的表征和優(yōu)化

進(jìn)行SDS?PAGE分析，以證明通過(guò)PCR進(jìn)行的DNA四面體。如圖3a（左）所示，與2個(gè)單鏈DNA（A，B）、2個(gè)雙鏈DNA（AB，CD）、2個(gè)三鏈DNA（ABC、BCD）、1個(gè)四鏈DNA（ABCD）和1個(gè)五鏈DNA（ABCDL）的圖像相比，凝膠電泳圖像表明DNA TSPs移動(dòng)速度更慢，證實(shí)了DNA TSPs的成功形成。通過(guò)AFM的DNA TSPs的表面形態(tài)如圖3a（右）所示。AFM圖像中的三角形表明DNA TSPs組裝成功。

圖3

TEM證實(shí)了MNRs和TDEs相結(jié)合的可行性。如圖3b所示，在MNRs表面觀察到具有典型磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的TDEs（用紅色箭頭表示），表明MNRs成功捕獲了TDE。

適配體與MNPs的結(jié)合取決于MNPs上的羧基與CD63適配體的氨基之間的脫水縮合。透射電鏡（TEM）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）光譜和DLS觀察結(jié)果證實(shí)了MNPs與CD63適配體之間的偶聯(lián)。如圖3c（a）所示，在MNPs的FTIR光譜中觀察到580 cm?1 （Fe-O）和1642 cm?1 （C = O）處的兩個(gè)峰（黑色）。與CD63適配體孵育后，在MNRs（黑色）的FTIR光譜中清晰地觀察到1378 cm?1 （C-N）、1538 cm?1 （N-H）、2850 cm?1和2920 cm?1（烷基鏈中的CH2）處的另外四個(gè)峰。如圖3c（b）所示，DLS揭示的MNPs和MNRs之間的尺寸變化表明，MNRs的直徑（276.9 nm）大于單分散MNPs（52.5 nm）。透射電鏡顯示，圖3c（c）中的MNRs發(fā)生了輕微的聚集，而圖3c（d）中的MNPs表現(xiàn)出良好的單一色散性。以上結(jié)果表明，MNP表面可以與CD63適配體成功偶聯(lián)。

μFMS的構(gòu)建和TDE檢測(cè)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

微流控芯片的目的是固定TSP和捕獲TDE。PDMS蛇形結(jié)構(gòu)的尺寸為500 μm寬和120 μm深（圖S1），與直線(xiàn)結(jié)構(gòu)（扁平芯片）相比，提供了更大的表面積（圖S2），可以提高TDE的捕獲效率。此外，氨基修飾的DNA TSPs通過(guò)胺和醛基之間的共價(jià)偶聯(lián)很容易固定在醛官能化載玻片上。

μFMS的性能通過(guò)磁性納米顆粒溶液的濃度梯度進(jìn)行校準(zhǔn)（圖S5）。結(jié)果表明，產(chǎn)生的電壓信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)磁性納米粒子的濃度具有良好的線(xiàn)性相關(guān)性，線(xiàn)性回歸方程表示為Y = 0.2091X + 0.00283 （R2 = 0.9997），證明所構(gòu)建的μFMS系統(tǒng)能夠定量檢測(cè)MNR捕獲的TDE。

使用DNA TSP修飾的蛇形芯片和扁平芯片證實(shí)了μFMS中蛇形芯片對(duì)TDE檢測(cè)的有效性。蛇形芯片組的電壓信號(hào)高于扁平芯片組，這意味著芯片上捕獲的TDE更多（圖S6A）。

使用醛修飾的載玻片基板制成的微流控芯片驗(yàn)證了基于DNA TSP的支架對(duì)TDE檢測(cè)的有效性，該芯片由雙鏈DNA（dsDNA）和TSP DNA固定的醛修飾載玻片基板組成。結(jié)果表明，DNA TSP組比dsDNA組具有更高的電壓信號(hào)，表明DNA TSPs具有更高的捕獲效率（圖S6B）。

TDE和MNR之間的孵育時(shí)間會(huì)影響分析過(guò)程。較短的孵育時(shí)間會(huì)導(dǎo)致 TDE 無(wú)法完全與 MNR 結(jié)合。較長(zhǎng)的孵育時(shí)間可能會(huì)加重適配體對(duì)MNPs的非特異性吸收。μFMS中的流速會(huì)影響TDEs和MNRs之間的結(jié)合效率，低流速會(huì)增加樣品處理時(shí)間;然而，高流速會(huì)導(dǎo)致 TDE 和 MNR 之間的孵育不足。為了通過(guò)μFMS獲得更高的TDEs檢測(cè)性能，優(yōu)化了孵育時(shí)間和流速。

如圖4a所示，當(dāng)TDE和MNR之間的孵育時(shí)間為10、30、60、90和120 min時(shí)，60 min可以達(dá)到最高的SNR（信噪比），這意味著微流控芯片上的TDE捕獲效率最高。因此，選擇60 min作為最佳孵育時(shí)間。

圖4

如圖4b所示，在最佳孵育時(shí)間（60 min）下，隨著流速的增加，信噪比信號(hào)增大，達(dá)到最高值并開(kāi)始減小。在 20 μL/min 的流速下實(shí)現(xiàn)的最高 SNR 意味著可以獲得 TDE 的最高捕獲效率。因此，選擇20 μL/min作為最佳流速。

設(shè)計(jì)梯度實(shí)驗(yàn)來(lái)優(yōu)化結(jié)合在MNPs上的CD63適配體濃度。如圖4c所示，當(dāng)CD63適配體濃度從0.05 μM增加到3 μM時(shí)，CD63-FAM-MNPs的熒光強(qiáng)度逐漸增加，并在濃度為3 μM時(shí)變得穩(wěn)定，這表明負(fù)載在MNPs表面的CD63適配體濃度已達(dá)到飽和。因此，選擇3 μM作為本實(shí)驗(yàn)的最佳適配體濃度。

用于TDE的μFMS的分析性能

優(yōu)化用于TDE檢測(cè)的μFMS的實(shí)驗(yàn)條件后，在微流控芯片上分析從PBS溶液中不同濃度的U251細(xì)胞系中分離得到的TDE。隨著TDE濃度從1.98 × 103增加到1.98 × 107 particles/mL，MNRs的信噪比也隨之增加（圖5a）。MNRs的信噪比與TDEs濃度對(duì)數(shù)之間的曲線(xiàn)擬合顯示出良好的線(xiàn)性關(guān)系（圖5b）。相關(guān)方程表示為SNR = 0.11219lg[TDE]-0.03004 （R2 = 0.9965）。由于濃度為 1.98 × 103 個(gè)顆粒/mL 時(shí)的 SNR 明顯低于閾值，即空白信號(hào)加上三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （3 SD），因此獲得了 1.98 × 103 個(gè)顆粒/mL 的檢測(cè)限 （LOD）（圖 5b，插圖）。

圖5

我們的μFMS方法和其他報(bào)道的用于TDE檢測(cè)的微流控平臺(tái)如表1所示。與大多數(shù)其他工作相比，我們的μFMS具有易于小型化、集成化和低成本等優(yōu)點(diǎn)，可以滿(mǎn)足臨床POCT的要求。此外，MNPs、DNA TSPs和微流控芯片與磁性生物傳感器的結(jié)合，確保了該方法能夠?qū)崿F(xiàn)靈敏和快速的檢測(cè)能力。檢測(cè)復(fù)雜生物樣品中的外泌體

為了驗(yàn)證μFMS對(duì)TDEs的臨床實(shí)用性，我們通過(guò)模擬臨床血清樣本評(píng)估了μFMS的檢測(cè)性能。從PBS溶液中U251細(xì)胞系中提取的TDEs與50%FBS和80%FBS模擬血清樣品的SNR沒(méi)有差異（圖6），這意味著我們構(gòu)建的μFMS可能是從真實(shí)臨床樣本中檢測(cè)TDEs的潛在分析方法。

圖6

回收率還用于評(píng)估制備的μFMS用于臨床樣本的可行性。所得結(jié)果分別為100%、106.83%和111.38%，表明我們的μFMS在復(fù)雜環(huán)境下對(duì)TDEs的檢測(cè)性能良好。

結(jié)論

在這項(xiàng)工作中，我們開(kāi)發(fā)了一種 DNA 四面體介導(dǎo)的 μFMS，用于具有高靈敏度和特異性的 TDE 片上檢測(cè)。我們?cè)O(shè)計(jì)并制造了一種以PDMS為上層，玻璃基板為下層的微流控芯片。在玻璃襯底上合成和修飾DNA四面體納米探針以捕獲TDE。將微流控芯片與包含感應(yīng)線(xiàn)圈的磁探測(cè)器和差分放大電路相結(jié)合。在驗(yàn)證了DNA四面體納米探針和微流控芯片在μFM中測(cè)量TDEs的可行性后，確定了μFMS在優(yōu)化條件下的檢測(cè)性能，線(xiàn)性動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍為1.98×103–1.98×107顆粒/mL，檢測(cè)限為1.98×103顆粒/mL。我們證明模擬血清系統(tǒng)和PBS緩沖液對(duì)TDEs的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有顯著差異。與其他TDE檢測(cè)策略相比，我們的μFMS在檢測(cè)靈敏度和時(shí)間方面表現(xiàn)出很大的優(yōu)勢(shì)。因此，我們開(kāi)發(fā)的μFMS系統(tǒng)可以為無(wú)創(chuàng)液體活檢提供非凡的選擇，并有可能成為有用的POCT工具。

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