摘要: 數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)近年來發(fā)展迅速。與以實時熒光定量PCR為代表的傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)顯著提高了定量分析的精確度和靈敏度。數(shù)字PCR的快速發(fā)展與近年來微流控技術(shù)在數(shù)字PCR技術(shù)中的廣泛應(yīng)用有著密切的聯(lián)系。早期的研究和商業(yè)化產(chǎn)品使用的是大規(guī)模集成流路微流控芯片，加工過程復(fù)雜且價格高昂。近年來，液滴微流控芯片被應(yīng)用到數(shù)字PCR技術(shù)中，它可以在短時間內(nèi)產(chǎn)生102～107個微液滴，每一個微液滴都是最多只含有一個目的基因片段的PCR反應(yīng)器。PCR擴增后，通過對單個微液滴的觀察計數(shù)，就可以獲得絕對定量的分析數(shù)據(jù)。本文綜述了不同種類的液滴微流控系統(tǒng)在數(shù)字PCR技術(shù)中的應(yīng)用，以及液滴數(shù)字PCR微流控芯片在生物、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域的應(yīng)用。

引言

早在1992年，已有學(xué)者提出了數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Digital PCR, dPCR)的概念，并且指出其在DNA的定量分析方面具有顯著優(yōu)勢。但是初期的dPCR技術(shù)發(fā)展十分緩慢，這是由于如果使用傳統(tǒng)的96孔板或者384孔板進(jìn)行PCR擴增，需要數(shù)個多孔板同時進(jìn)行擴增，不僅操作復(fù)雜，且實驗樣品和試劑的消耗量非常大。在當(dāng)時的條件下，研究者很難開展數(shù)字PCR的研究。此外，在DNA定量研究方面，由于實時熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)等技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，也使得dPCR技術(shù)的發(fā)展緩慢。

隨著微流控技術(shù)的出現(xiàn)和近年來的高速發(fā)展，研究者嘗試將微流控技術(shù)與數(shù)字PCR技術(shù)結(jié)合起來。與微流控芯片結(jié)合后的dPCR技術(shù)的靈敏度和精確度有了很大提高，在單細(xì)胞研究、基因測序、醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品安等領(lǐng)域得到了越來越多的應(yīng)用，展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用潛力。近年來，還涌現(xiàn)出一批商業(yè)化的dPCR檢測設(shè)備。本文綜述了近年來dPCR技術(shù)及液滴微流控芯片的發(fā)展?fàn)顩r，并介紹了dPCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域的實際應(yīng)用情況。

dPCR原理

傳統(tǒng)的實時定量PCR以指數(shù)形式體現(xiàn)定量信息，而dPCR技術(shù)所能提供的DNA量化信息是以線性的數(shù)字化形式體現(xiàn)的。dPCR的原理如圖 1所示，將含有目標(biāo)基因、引物、聚合酶等的溶液稀釋后，根據(jù)實驗需要被分成102~107份不等的溶液(反應(yīng)單元)，每份溶液中至多只含有一個目的基因拷貝。這些溶液單元經(jīng)過與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相同的熱循環(huán)擴增后，對每份溶液進(jìn)行檢測。如果含有目的基因，則計為“1”(陽性反應(yīng))；不含有目的基因，則計為“0”(陰性反應(yīng))，這些代表陽性反應(yīng)的數(shù)字“1”和代表陰性反應(yīng)的數(shù)字“0”類似于數(shù)字電路中的通和斷兩種狀態(tài)，這也是dPCR名稱的由來。最后通過對陽性反應(yīng)的單元計數(shù)可以獲知擴增之前目的基因的絕對數(shù)量?？紤]到有可能出現(xiàn)擴增前一個反應(yīng)單元里有兩個或以上目的基因的情況，使用泊松分布進(jìn)行校正可以進(jìn)一步增加對擴增前目的基因計量的準(zhǔn)確度。

與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，由于熱循環(huán)和熒光探針標(biāo)記等技術(shù)已經(jīng)較為成熟，dPCR主要的技術(shù)難點體現(xiàn)在對稀釋后的反應(yīng)溶液進(jìn)行大規(guī)模等分的技術(shù)上。在對稀釋后的溶液進(jìn)行等分方面，最初采用了96孔或384孔板的方法，但這種方法試劑消耗量巨大(每孔約5μL)，且可實現(xiàn)的反應(yīng)單元數(shù)量較少。后來盡管在反應(yīng)單元的數(shù)量上有所增加，如Shen等在玻璃基底加工了1280個反應(yīng)單元，但仍存在溶液等分不能自動完成和反應(yīng)單元數(shù)量較少的問題。直到微流控技術(shù)被應(yīng)用到dPCR領(lǐng)域后，反應(yīng)單元的數(shù)量才得到了爆發(fā)式的增長。關(guān)于微流控技術(shù)在dPCR領(lǐng)域的應(yīng)用，本文后續(xù)部分會詳細(xì)介紹。

為了進(jìn)一步說明dPCR技術(shù)的原理，圖 2顯示了dPCR技術(shù)在胎兒早期疾病診斷中的應(yīng)用。圖 2a是檢測過程中一組12塊多孔板中的1塊，具有765個反應(yīng)單元，每個反應(yīng)單元的容積為6 nL，含有目標(biāo)基因、引物、熒光探針等的反應(yīng)溶液通過微流控技術(shù)被均勻送入各個反應(yīng)單元中。經(jīng)過PCR擴增后，由TaqMan探針標(biāo)記的含有目標(biāo)基因的反應(yīng)單元發(fā)出熒光，可以很容易地觀察到。經(jīng)過計算機圖像處理，轉(zhuǎn)換為圖 2b所示的熱點圖(Heat map), 每個紅點代表一個含有目標(biāo)基因的反應(yīng)單元，通過熱點圖就可以準(zhǔn)確分析出目標(biāo)基因的數(shù)量。圖 2c是作為參考的dPCR的擴增曲線，需要指出的是，dPCR對目標(biāo)基因的測量并不需要擴增曲線的幫助，而在實時熒光定量PCR檢測中，對目標(biāo)基因擴增數(shù)量的檢測直接依賴于與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對比，由于標(biāo)準(zhǔn)曲線與實際樣品擴增效率不同等原因，導(dǎo)致熒光實時定量PCR檢測的準(zhǔn)確度偏低。Hindson和Whale等對實時熒光PCR技術(shù)和dPCR技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)對比，結(jié)果表明，相比于實時熒光定量PCR，dPCR對目標(biāo)基因定量檢測的靈敏度、精度、檢測時間等方面有著非常顯著的優(yōu)勢。在檢測精度方面，dPCR與實時熒光PCR相比，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)顯著減小，測量精密度提高；在檢測時間方面，如果保持與熒光PCR相同的精度，dPCR的日檢測量增加了7倍。

早期的微流控技術(shù)與dPCR的結(jié)合應(yīng)用體現(xiàn)在以集成流路微流控芯片(Integrated fluid circuit, IFC)為基礎(chǔ)的dPCR技術(shù)。這種微流控芯片采用多層光刻技術(shù)加工而成，具有非常復(fù)雜的流路結(jié)構(gòu)以及氣動的微泵與微閥，通過微泵和微閥將溶液送入反應(yīng)腔陣列，其加工過程復(fù)雜，成本非常高，且受到加工技術(shù)和成本的限制，IFC芯片可以實現(xiàn)的反應(yīng)單元數(shù)量一般不超過10000個。

近年來，液滴微流控技術(shù)的發(fā)展給dPCR帶來了新的發(fā)展機遇。采用液滴微流控技術(shù)，經(jīng)過高度稀釋的含有模板DNA和引物等的反應(yīng)溶液可以在微流控芯片中很容易地被分成102~107小液滴，每個體積只有納升甚至皮升的小液滴都是只含有最多一個目的基因的微型反應(yīng)器，經(jīng)過PCR擴增后，通過熒光檢測，可以很直觀地定量分析出原始溶液中目的基因的拷貝數(shù)量。

與IFC芯片相比，液滴微流控芯片的優(yōu)勢不止體現(xiàn)在反應(yīng)單元的數(shù)量，其最大優(yōu)勢在于成本方面：IFC芯片的加工采用接近納米尺度的多層光刻技術(shù)，成本非常高；而液滴微流控芯片大多只有一層結(jié)構(gòu)，且加工尺度在微米級，因此大大降低了芯片的加工成本(微流控芯片的加工成本占芯片總成本的大部分)，這對于dPCR技術(shù)的發(fā)展至關(guān)重要。

微流控系統(tǒng)中微液滴的產(chǎn)生方法

如前所述，微流控技術(shù)對于dPCR發(fā)展的貢獻(xiàn)主要在于可以大規(guī)模增加反應(yīng)單元的數(shù)量，通過微流控技術(shù)，高效精確地將樣本溶液分割為102~107份。微流控技術(shù)對樣本溶液的分割，最初是由氣動微泵、微閥控制分割樣本溶液的IFC芯片，不僅結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，加工難度也較大，可以分割的份數(shù)也非常有限，單塊芯片的成本非常高。近年來，研究者開始使用微流控系統(tǒng)產(chǎn)生大量微液滴的辦法實現(xiàn)對樣本溶液的分割，每個產(chǎn)生的含有目的基因、探針和引物等的微液滴都可以作為一個獨立的反應(yīng)單元進(jìn)行PCR擴增，而微滴產(chǎn)生的速度、數(shù)量、體積等均可以通過微流控系統(tǒng)精確控制。相比于IFC芯片，液滴微流控芯片的加工過程簡單，成本低廉，代表了未來微流控與dPCR結(jié)合的發(fā)展方向。下面將結(jié)合微液滴在dPCR領(lǐng)域的應(yīng)用，簡要介紹使用微流控系統(tǒng)產(chǎn)生及操控微液滴的技術(shù)。

通過微流控系統(tǒng)產(chǎn)生大量應(yīng)用于dPCR技術(shù)的微液滴，最常用的方法是乳化技術(shù)(Emulsion)，即兩種不相溶的液體混合時，一種液體會以微滴的形式分散在另一種溶液中。微流控芯片可以在微尺度上對一種溶液(分散相)在另外一種不相溶的溶液(連續(xù)相)中產(chǎn)生微液滴的過程進(jìn)行精確控制，繼而獲得大量體積在納升甚至皮升級，且大小均一的微液滴。

圖 3顯示了使用液滴dPCR技術(shù)對癌癥基因進(jìn)行篩選和測序的應(yīng)用研究。如圖 3所示，在一個T形(T-junction)的微通道中，黃色代表油，藍(lán)色代表包含引物、熒光探針以及目標(biāo)基因等的水溶液。由于兩種液體不相溶，在微通道的液體流動過程中，油在微通道內(nèi)在向左側(cè)流動的過程中對水溶液不斷進(jìn)行擠壓，作為分散相的水溶液在連續(xù)相油的不斷擠壓中被最終剪斷，形成了一個微液滴(本例中體積為2.5 nL)。分散后的微液滴含有至多一個目的基因以及引物、熒光探針等，分散后的液滴可以使用傳統(tǒng)的PCR技術(shù)進(jìn)行擴增，由于油的阻隔，在擴增過程中，每個微液滴都是一個相對獨立的反應(yīng)單位。

除了圖 3所展示的T形微通道的液滴產(chǎn)生系統(tǒng)，類似的還有Y形、十字形等多種微通道結(jié)構(gòu)，都可以用于產(chǎn)生微液滴。除了乳化法之外，還可以采用流動聚焦(Flow-focusing)等方法產(chǎn)生單/雙/多層包裹的微液滴。采用微流控技術(shù)產(chǎn)生微液滴的大小與微通道的尺寸及連續(xù)相和分散相的流速、粘度等都有直接關(guān)系?，F(xiàn)階段使用微流控技術(shù)可以產(chǎn)生的微液滴的體積范圍從0.05 pL到1 nL不等，對應(yīng)的微液滴直徑為5~120μm，實際應(yīng)用中可以靈活選擇。文獻(xiàn)中采用的是以油包水(W/O)方式產(chǎn)生的微液滴，根據(jù)實驗需要，同樣的微流控系統(tǒng)還可以產(chǎn)生水包油(O/W)的微液滴，甚至氣體包水(W/G)的微液滴。

在連續(xù)相液體的選擇方面，多采用礦物油(Mineral oil)，對微液滴形狀的保持和微液滴間的阻隔起到了重要作用，且對微液滴中參與PCR擴增的生物大分子、酶等的活性和結(jié)構(gòu)沒有影響。為了增強液滴產(chǎn)生的穩(wěn)定性和控制分散相微液滴的大小，有的研究者在礦物油中加入了0.5%~3.0%的表面活性劑。在水或油中添加表面活性劑對微液滴的穩(wěn)定起到了重要作用，且未發(fā)現(xiàn)毒副作用。未來的研究中，可以通過改變微通道表面的物理化學(xué)性質(zhì)等方法(物理/化學(xué)修飾)，增加微流控系統(tǒng)產(chǎn)生微液滴的穩(wěn)定性，從而擺脫對價格昂貴的表面活性劑的依賴，減少對溶液的污染。

微流控芯片材料的選擇與其應(yīng)用環(huán)境有直接關(guān)系。目前，在dPCR領(lǐng)域，無論是IFC芯片，還是液滴微流控芯片，通常使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材質(zhì)的微流控芯片。PDMS具有良好的生物相容性和透氣性，且微加工性能良好，但在某些有機溶劑的作用下會發(fā)生溶解和變形。根據(jù)目前微流控技術(shù)發(fā)展的總體趨勢，未來非常有可能產(chǎn)生基于熱塑性塑料(如：PMMA、PS、PC等)，甚至紙基等低成本微流控dPCR芯片。

微液滴的高通量生成技術(shù)

液滴微流控芯片在dPCR領(lǐng)域的應(yīng)用是利用了液滴微流控系統(tǒng)可以迅速產(chǎn)生大量的微液滴的優(yōu)勢。近年來，在產(chǎn)生高通量微液滴的微流控芯片方面進(jìn)行了大量研究，目前，單一微液滴產(chǎn)生裝置的液滴產(chǎn)生速度可以高達(dá)10 kHz，如果將多塊微流控芯片并行使用，或者在一塊微流控芯片上加工數(shù)十到數(shù)百個微液滴產(chǎn)生裝置，還可以極大提升液滴的產(chǎn)生速度。Nisisako等在一塊圓形的玻璃基底上呈輻射狀排布了128個Y形微液滴產(chǎn)生器，每小時可產(chǎn)生1 L粒徑為96.4μm的微液滴。

圖 4展示了Holtze等制作的高速微液滴發(fā)生微流控芯片，芯片采用了軟光刻的方法，使用傳統(tǒng)紫外光刻技術(shù)對SU-8進(jìn)行曝光沖洗后，利用SU-8作為模具，對PDMS進(jìn)行倒模，最后將PDMS鍵合在玻璃片上制成微流控芯片。他們不僅在連續(xù)相的油中添加了表面活性劑，還在分散相的水中也添加了具有良好生物相容性的表面活性劑(PFPE-PEG共聚物)，從而極大提高了微液滴高速產(chǎn)生時的穩(wěn)定性，液滴的產(chǎn)生速度可以達(dá)到30 kHz(圖 4a)。從圖 4b可見，隨著微通道內(nèi)油流量上升，微液滴的產(chǎn)生速度也迅速上升，產(chǎn)生的微液滴的直徑隨之變小。為了驗證PFPE-PEG共聚物作為表面活性劑的生物兼容性，在微液滴中進(jìn)行了質(zhì)粒DNA體外編譯β-Galactosidase酶的實驗，獲得了滿意的效果。

值得注意的是，高通量的微液滴產(chǎn)生技術(shù)對微流控芯片系統(tǒng)以及擴增后的液滴熒光檢測都提出了更高的要求。首先，產(chǎn)生高通量液滴的微流控芯片對反應(yīng)液體進(jìn)樣的穩(wěn)定性和連續(xù)性都提出了更高要求，這種情況下，反應(yīng)液體進(jìn)樣常需要通過價格高昂的恒壓泵實現(xiàn)。其次，高通量的液滴產(chǎn)生微流控系統(tǒng)對芯片的鍵合也提出了更高要求，內(nèi)部的高壓液體對芯片的鍵合強度要求更高。最后，對液滴的熒光檢測的速度方面也提出了更高要求，檢測系統(tǒng)不僅需要在極短時間內(nèi)對微流控芯片中按順序排布流動的微液滴進(jìn)行熒光檢測，還需要高速的數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計能力。

 dPCR與液滴微流控芯片的結(jié)合和應(yīng)用

目前，基于液滴微流控芯片的dPCR(Droplet digital PCR, ddPCR)已被廣泛應(yīng)用于疾病檢測、基因診斷、基因測序、食品安全等多個領(lǐng)域。

在疾病檢測和基因診斷方面，Heredia等采用液滴dPCR技術(shù)對乳腺癌腫瘤細(xì)胞中的表皮生長因子受體(HER2)的表達(dá)水平進(jìn)行了研究。與之前研究者的結(jié)果相比，采用dPCR顯著提高了對HER2表達(dá)水平的準(zhǔn)確度，為研究HER2表達(dá)水平與乳腺癌發(fā)病之間的關(guān)系提供了準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。dPCR技術(shù)在疾病診斷領(lǐng)域的應(yīng)用遠(yuǎn)不止于乳腺癌領(lǐng)域，在肺癌、結(jié)腸癌等疾病的檢測領(lǐng)域，研究者也利用dPCR技術(shù)對其相應(yīng)的標(biāo)志物(如：EGFR、KRAS等)進(jìn)行了檢測，從而實現(xiàn)了在基因水平上對疾病診斷的目的。利用dPCR技術(shù)的高靈敏度，還可以對微量的游離在血液中的腫瘤導(dǎo)致的CNAs進(jìn)行檢測，對于癌癥的早期診斷有著重要的意義。實驗表明，利用dPCR技術(shù)，可以達(dá)到在106個野生型中檢測出一個突變基因的靈敏度。Contente-Cuomo等使用液滴dPCR對微量的游離在細(xì)胞外可作為癌癥標(biāo)志物的DNA片段進(jìn)行了檢測，驗證了在血液的復(fù)雜背景中，利用dPCR技術(shù)對循環(huán)腫瘤標(biāo)志物檢測的可行性。

在環(huán)境工程和食品安全領(lǐng)域，Bian等采用經(jīng)過油飽和處理的基于PDMS材料的微流控芯片，對飲用水中E. coliO157和L. monocytogenes兩種細(xì)菌進(jìn)行了dPCR檢測(圖 5)，分別用兩種不同顏色的熒光探針標(biāo)記兩種細(xì)菌，PCR擴增后可以同時對兩種顏色熒光微液滴進(jìn)行檢測計數(shù)，從而得到兩種細(xì)菌在初始溶液中的絕對定量結(jié)果，用這種方法對飲用水的檢測精度可以達(dá)到10 CFU/mL。在食品安全領(lǐng)域，為了適應(yīng)歐盟對轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的嚴(yán)格要求，Dobnik等[51]提出并驗證了利用液滴dPCR技術(shù)對歐盟境內(nèi)種植的12種轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行快速檢測的方法。Dany等也使用dPCR—實時熒光PCR聯(lián)用技術(shù)對食品、飼料、種子中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行了測定，在提高精度的同時也降低了檢測成本。

在液滴微流控技術(shù)與dPCR的結(jié)合應(yīng)用方面也有一些商業(yè)化產(chǎn)品，如Bio-Rad公司的QX系列液滴dPCR檢測系統(tǒng)，其中QX100系統(tǒng)中的液滴微流控芯片可以在一次分析中將樣品溶液分成11.2萬~12.8萬個小液滴，每塊芯片的價格僅為24美元。在QX100系統(tǒng)中，使用了前文提到過的十字形的微流道，分散相溶液在連續(xù)相油的擠壓中不斷產(chǎn)生小液滴，通過數(shù)個液滴產(chǎn)生微流控芯片的并行協(xié)作，在短時間內(nèi)產(chǎn)生了大量的小液滴，每個小液滴就是一個反應(yīng)容器；PCR熱循環(huán)擴增結(jié)束后，又使用微流控技術(shù)，使小液滴依次通過檢測裝置對其進(jìn)行熒光檢測，完成計數(shù)過程。與之相似，RainDance公司的Rraindrop系統(tǒng)附帶的微流控芯片的8個進(jìn)樣通道同時工作時，最高可將樣品溶液分為8000萬個pL級的微液滴，每塊微流控芯片的成本也只有80~240美元。相比之下，F(xiàn)luidigm公司BioMark系統(tǒng)使用的基于IFC技術(shù)的微流控芯片中的12個反應(yīng)單元陣列加起來也僅有9180個反應(yīng)單元，每塊芯片價格卻高達(dá)400美元。由此可見，從單個芯片的價格和對反應(yīng)溶液分割的份數(shù)來看，液滴微流控芯片相比于IFC芯片都擁有巨大的優(yōu)勢。

典型的商業(yè)化液滴dPCR系統(tǒng)的工作原理如圖 6所示，含有目的基因、Taq聚合酶、引物、分子信標(biāo)(如：TaqMan等)的溶液經(jīng)過微流控芯片，被分為數(shù)百萬個微液滴，分散的微液滴被收集在離心管中進(jìn)行PCR熱循環(huán)擴增，擴增的同時，通過熒光探針/分子信標(biāo)標(biāo)記目的基因，最后，微液滴被重新送入微流控芯片中，微液滴依次通過熒光傳感器進(jìn)行檢測，最后得到數(shù)據(jù)分析圖。值得一提的是，現(xiàn)階段微液滴一般可以通過熒光探針標(biāo)記兩種顏色，如果對熒光探針的強度進(jìn)行控制，基于兩種顏色的探針最多可以達(dá)到12個標(biāo)記的多重分析。

結(jié)語和展望

與傳統(tǒng)的依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線和循環(huán)閾值進(jìn)行定量檢測的實時熒光PCR技術(shù)相比，在目標(biāo)基因的定量精度和靈敏度方面，dPCR具有非常明顯優(yōu)勢：通過對溶液的高度稀釋和分割，每份溶液中都至多含有一個目標(biāo)基因，在擴增后，通過熒光檢測，可以準(zhǔn)確定量分析出原始溶液中的目標(biāo)基因數(shù)量。

dPCR技術(shù)在基因工程、疾病檢測以及環(huán)境工程等領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用，無疑是未來PCR技術(shù)的發(fā)展方向。液滴dPCR是近年來興起的一項新dPCR技術(shù)，是微流控技術(shù)與dPCR結(jié)合產(chǎn)生的新成果。相比于基于IFC的dPCR芯片，液滴dPCR對反應(yīng)溶液的分割數(shù)量增加了上千倍，可以容易地將反應(yīng)溶液分割為數(shù)百萬份含有至多一個目標(biāo)基因的微液滴，大大提高了定量分析精密度，不僅推動了dPCR在更多領(lǐng)域的應(yīng)用，且顯著降低了dPCR技術(shù)的成本。

目前，包括液滴dPCR在內(nèi)的整個dPCR技術(shù)還處于發(fā)展初期，與液滴dPCR相關(guān)的液滴微流控芯片技術(shù)、多重?zé)晒馓结?、反?yīng)后微液滴的高速檢測等相比還有很大發(fā)展的空間。在液滴微流控芯片技術(shù)方面，其技術(shù)難點在于大規(guī)模高通量的液滴產(chǎn)生技術(shù)，高通量往往是通過增加芯片中的液體流動速度和采用數(shù)塊微流控芯片并行運作實現(xiàn)的，這對芯片的設(shè)計、微通道的加工、芯片的鍵合等都提出了更高的要求，是未來技術(shù)攻關(guān)的重要難點之一。在多重?zé)晒馓结樀氖褂梅矫?，多?shù)實驗室研究和商業(yè)化產(chǎn)品使用的都是1~2個熒光探針，可以實現(xiàn)對1~2個目標(biāo)基因的同時檢測。在未來的dPCR技術(shù)發(fā)展中，提高熒光探針數(shù)量必然是發(fā)展趨勢之一，在一次dPCR檢測中對多個目標(biāo)基因進(jìn)行定量分析，大大提高效率，降低成本，對醫(yī)學(xué)檢測等領(lǐng)域的應(yīng)用有著重要意義。前面提到的高通量液滴產(chǎn)生技術(shù)和多重?zé)晒馓结樇夹g(shù)也都對PCR擴增后的熒光檢測系統(tǒng)提出了更高的要求，在非常短的時間內(nèi)，不僅需要熒光檢測系統(tǒng)對液滴是否具有熒光做出判定，還需要對熒光的顏色做出準(zhǔn)確判斷，所以，未來dPCR技術(shù)發(fā)展中高速熒光檢測和信號處理也是亟待解決的難題。

此外，值得重點關(guān)注的是液滴dPCR技術(shù)的高成本問題。目前，為了保證內(nèi)部微流道潔凈，只能一次性使用的液滴微流控芯片的成本仍然過高，使得整個液滴dPCR技術(shù)的檢測成本高昂，影響了液滴dPCR技術(shù)的普及。微流控芯片成本的絕大部分源自微加工技術(shù)和芯片材料，相信未來隨著微流控技術(shù)的高速發(fā)展，各種低成本的微加工方法的不斷涌現(xiàn)和各類低成本材料的使用，會在很大程度上降低液滴dPCR技術(shù)的成本。從降低成本方面考慮，研發(fā)應(yīng)用于液滴dPCR技術(shù)中的高通量、低成本微流控芯片也必將是未來的發(fā)展方向之一。

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