1 染料定性表征濃度梯度

隨著熒光素鈉與莧菜紅流速比的增加, 熒光素鈉成分在通道中所占比例逐漸增加。當(dāng)流速比 < 1時(shí), 莧菜紅在4個(gè)通道中含量較高(圖 2A~D); 當(dāng)流速比 > 1時(shí), 熒光素鈉在4個(gè)通道中含量較高, 不利于拉開濃度差異, 形成濃度梯度(圖 2I~L、M~P); 當(dāng)兩水相流速比為1時(shí)(即流速均為100 μL·h-1), 芯片可以生成較好的濃度梯度, 接近于線性濃度梯度(圖 2E~H)。同時(shí), 結(jié)果可以看出當(dāng)流速差異較大時(shí), 兩水相分界清晰, 流體在流動(dòng)過程中不能充分?jǐn)U散(圖 2I~L、M~P)。所以選擇兩水相流速均為100 μL·h-1作為后續(xù)藥物篩選實(shí)驗(yàn)時(shí)的水相流速。

2 HPLC定量表征濃度梯度

氟康唑在1~100 μg·mL-1內(nèi)線性良好, 回歸方程為f = 1 769.3×C - 1 507.3 (r = 0.999 7)?？瞻兹芤号c100 μg·mL-1氟康唑溶液流速比1:2、1:1、2:1, 分別收集4個(gè)通道樣本進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果見表 1。當(dāng)流速為1:2和2:1時(shí), 溶液流速差異大, 高流速溶液流經(jīng)同樣距離所需時(shí)長(zhǎng)越短, 橫向擴(kuò)散距離也較短, 分支中溶液混合情況差, 難以形成線性濃度梯度。當(dāng)空白溶液與工作溶液流速比為1:1時(shí), 各分支溶液能夠較充分混勻從而能夠獲得更加接近線性的濃度梯度, 與熒光素鈉對(duì)芯片濃度梯度定性結(jié)果一致。

3 濃度梯度微流控芯片的系統(tǒng)考察

為了生成大小均勻、形狀穩(wěn)定的液滴, 考察了芯片上的水油兩相流速, 見圖 3。結(jié)果表明, 水相流速100 μL·h-1、油相流速200 μL·h-1時(shí), 液滴大小均一, 形態(tài)良好, 液滴直徑約為47 μm, 體積約54 pL, 生成速度約為每秒2.6×104個(gè)。收集的液滴涂布于載玻片上觀察, 液滴形態(tài)比較穩(wěn)定, 尺寸均一, 放置3天, 液滴仍能保持形態(tài)完好, 穩(wěn)定性高, 完全滿足實(shí)驗(yàn)要求。

4 液滴包裹白念珠菌考察

白念珠菌菌液與空白培養(yǎng)基作為兩水相包裹形成液滴后, 涂片于載玻片, 顯微鏡下拍照觀察。對(duì)液滴直徑進(jìn)行測(cè)量和標(biāo)記, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)液滴直徑基本為46.64 μm, 尺寸大小基本保持一致, 液滴均一性良好。白念珠菌經(jīng)活死染料標(biāo)記, 可以清晰地觀察到大多數(shù)液滴為空液滴, 而包裹了白念珠菌的液滴基本為單包裹。由于白念珠菌濃度為0.5×103~2.5×103 CFU·mL-1, 菌液濃度相對(duì)較低, 分散到每個(gè)液滴內(nèi)的白念珠菌基本為1個(gè)或沒有, 因此液滴絕大多數(shù)為單包裹(圖 4)。在單細(xì)胞包裹液滴中, 當(dāng)藥物抑制或者殺滅真菌細(xì)胞時(shí), 無熒光亮液滴, 顯示與空液滴一樣的背景色。當(dāng)藥物濃度低于MIC時(shí), 真菌細(xì)胞有生長(zhǎng)活性, 指示劑轉(zhuǎn)化產(chǎn)生熒光亮液滴, 而空液滴保持不變。由此可以判斷藥物的MIC。因此, 通道內(nèi)白念珠菌的濃度梯度分布不影響后續(xù)的藥物篩選實(shí)驗(yàn)。

5 基于濃度梯度微流控芯片的抗真菌藥物快速篩選研究

分別測(cè)試高低濃度的兩性霉素B的抗白念珠菌作用, 高濃度組水相分別為含16.0 μg·mL-1兩性霉素B的藥物溶液和含終濃度為0.5×103~2.5×103 CFU·mL-1白念珠菌的溶液, 低濃度組兩性霉素B濃度為4.0 μg·mL-1, 其余組成相同。16.0 μg·mL-1兩性霉素B濃度梯度微流控芯片抗真菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 5?？瞻讓?duì)照組中液滴只包裹了藥物溶液(無菌), 可見液滴顏色均勻一致為背景的紅色, 液滴無熒光(圖 5A); 生長(zhǎng)對(duì)照組(無藥), 熒光亮液滴較多(圖 5D), 圖 5B~C中液滴無熒光, 表明白念珠菌的活力被兩性霉素B抑制, 無法有效轉(zhuǎn)化熒光指示劑產(chǎn)生熒光。

4.0 μg·mL-1兩性霉素B液滴實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 6, A~D分別為通道1、通道2、通道3、通道4出口處收集液滴孵育2 h后的結(jié)果。根據(jù)氟康唑濃度梯度定量表征結(jié)果推算, 圖 6A~D中兩性霉素B分別為4.0、1.6、0.5和0 μg·mL-1。A為空白對(duì)照組, 無熒光亮液滴; D為正常生長(zhǎng)對(duì)照組, 產(chǎn)生大量亮液滴。圖 6B中所示為藥物溶液與菌溶液混合后的液滴作用情況, 液滴中無明顯熒光信號(hào)產(chǎn)生, 表明該濃度條件兩性霉素B可以有效抑制白念珠菌生長(zhǎng), 兩性霉素B濃度約為1.6 μg·mL-1; 圖 6C中可以看到液滴存在明顯的明暗區(qū)別, 表明液滴內(nèi)包裹的白念珠菌未能被有效抑制, 而兩性霉素B濃度約為0.50 μg·mL-1, 因此可以得出兩性霉素B的MIC值在0.50~1.60 μg·mL-1內(nèi), 與CLSI所建議的兩性霉素B對(duì)白念珠菌的MIC≤1 μg·mL-1相一致。結(jié)果表明本研究建立的濃度梯度微流控芯片平臺(tái)可以用于快速測(cè)定抗真菌候選化合物的MIC, 通過一次實(shí)驗(yàn)獲得化合物的MIC范圍(表 2)。

氟康唑、卡泊芬凈、特比萘芬等藥物結(jié)果與96孔板法一致。圖 7顯示了16 μg·mL-1特比萘芬抗白念珠菌藥物篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中, 7B~D中均有熒光亮液滴, 說明兩種濃度的特比萘芬均不能有效抑制該批次白念珠菌的活性, 該批次白念珠菌對(duì)特比萘芬產(chǎn)生了耐藥的現(xiàn)象。有文獻(xiàn)報(bào)道, 在臨床獲得的白念珠菌樣品中, 對(duì)特比萘芬的耐藥比例達(dá)94.93%, 而伊曲康唑和咪康唑的耐藥率則只有15.21%和5.99%。本研究所建立的抗白念珠菌藥物篩選的方法也可以應(yīng)用于臨床耐藥菌株的藥物篩選研究。

討論

在微流控芯片上生成濃度梯度具有自動(dòng)化、微型化、高通量的優(yōu)點(diǎn), 因此被廣泛應(yīng)用于藥物篩選、細(xì)胞生物學(xué)等研究領(lǐng)域。本研究采用液滴微流控技術(shù)結(jié)合濃度梯度生成的芯片包裹白念珠菌進(jìn)行抗真菌藥物活性快速高效測(cè)試。通過熒光示蹤劑熒光素鈉和莧菜紅色素考察芯片上兩水相流速比對(duì)濃度梯度形成結(jié)果的影響, 并對(duì)芯片濃度梯度進(jìn)行了定性表征, 結(jié)合HPLC對(duì)通道內(nèi)氟康唑濃度的定量從而對(duì)芯片濃度梯度進(jìn)一步進(jìn)行定量表征。濃度梯度定性與定量結(jié)果一致表明, 當(dāng)兩水相流速比為1 : 1時(shí), 流速為100 μL·h-1時(shí), 芯片內(nèi)濃度梯度分布更加均勻, 濃度梯度分布接近線性, 適用于后續(xù)藥物篩選實(shí)驗(yàn)。通過活死染色考察芯片上濃度梯度生成器對(duì)白念珠菌在通道中分布及液滴內(nèi)包裹白念珠菌情況的影響, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)液滴內(nèi)白念珠菌基本為單包裹, 藥物作用對(duì)象保持一致。

采用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)制作的濃度梯度液滴微流控芯片, 測(cè)試了8種臨床常用藥物的抗白念珠菌作用效果。通過對(duì)兩性霉素B、氟康唑及特比奈芬等藥物的作用效果考察發(fā)現(xiàn), 芯片結(jié)果與孔板法一致, 并與M27-A3標(biāo)準(zhǔn)所認(rèn)定的MIC值相符, 表明本研究建立的多濃度梯度液滴生成芯片平臺(tái)可以用于抗真菌活性化合物的快速篩選及臨床耐藥菌株的篩選研究。傳統(tǒng)孔板法藥敏實(shí)驗(yàn)需要耗費(fèi)大量人力物力, 難以實(shí)現(xiàn)高通量分析。

近年來, 濃度梯度微流控芯片技術(shù)逐漸興起, 出現(xiàn)大量能夠產(chǎn)生線性和非線性濃度梯度的微流控芯片, 但其結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜、制作要求較高, 芯片穩(wěn)定性和重現(xiàn)性易受影響。本文建立的濃度梯度液滴微流控芯片平臺(tái)將濃度梯度生成器和液滴生成結(jié)構(gòu)組合在一起, 濃度梯度生成器采用經(jīng)典的“圣誕樹”結(jié)構(gòu), 可通過簡(jiǎn)單地增加分支數(shù)目而獲得更多的濃度梯度分布, 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單易于制作, 并且芯片穩(wěn)定性高, 易于操作, 能夠快速生成較為精確、穩(wěn)定的濃度梯度。將該平臺(tái)應(yīng)用于抗真菌藥物篩選, 可以省去配制多種不同藥物濃度溶液的繁冗過程, 同時(shí)簡(jiǎn)化了細(xì)胞鋪板、給藥、標(biāo)記等過程。在短時(shí)間內(nèi)可以生成大量液滴, 每個(gè)液滴作為獨(dú)立微反應(yīng)器, 作用結(jié)果互不干擾, 增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性與準(zhǔn)確性。后期通過改進(jìn)芯片“圣誕樹”結(jié)構(gòu)濃度梯度分支數(shù)目, 增加芯片的濃度梯度生成數(shù)量, 可以將一次實(shí)驗(yàn)所獲得的濃度梯度間隔劃分的更小, 有望通過一次實(shí)驗(yàn)獲得精確的MIC值; 通過改變濃度梯度生成器結(jié)構(gòu), 可以產(chǎn)生正交濃度梯度用于聯(lián)合用藥的研究。

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