8. 微流體：提高生理相關(guān)性的宏觀步驟

微流體依靠使用高度或?qū)挾葹?/span>10-100微米的小通道來處理少量流體。與其他更傳統(tǒng)的3D細(xì)胞模型相比，它們的關(guān)鍵屬性是它們能夠更好地控制細(xì)胞、物理和生化微環(huán)境。這使研究人員能夠重建復(fù)雜的細(xì)胞模型，更真實(shí)地模擬人體組織。
微流控芯片的設(shè)計(jì)可以由許多不同的通道或隔間組成，可以很容易地適應(yīng)研究人員的需要。這種分區(qū)允許在生理長(zhǎng)度尺度上對(duì)細(xì)胞分布進(jìn)行獨(dú)特的空間控制，特別是對(duì)于不同細(xì)胞類型的共培養(yǎng)。許多微芯片現(xiàn)在已經(jīng)在微芯片上集成了電子和機(jī)械執(zhí)行器，例如閥門或開關(guān)，這有助于在同一芯片上實(shí)現(xiàn)幾個(gè)連續(xù)的步驟。這一概念通常被稱為芯片上實(shí)驗(yàn)室：許多耗時(shí)的實(shí)驗(yàn)室任務(wù)可以被微型化并自動(dòng)化到微流控芯片上。與傳統(tǒng)的宏觀分析相比，這種小型化還減少了所需試劑和細(xì)胞的體積，從而降低了成本。
通道的存在允許在生理長(zhǎng)度范圍內(nèi)控制流量。這有助于跨通道形成化學(xué)或物理梯度(例如，細(xì)胞因子梯度或間質(zhì)壓力)，這在許多生物過程中是重要的。測(cè)定中流動(dòng)的建立有利于介質(zhì)的灌流，重建重要的生物力學(xué)過程，如剪切力，或簡(jiǎn)單地允許重建血流中細(xì)胞的流體環(huán)境。
最后但并非最不重要的一點(diǎn)是，微流控芯片中的細(xì)胞與顯微鏡物鏡之間的距離較短，能夠以比其他傳統(tǒng)的體外宏觀系統(tǒng)更高的分辨率成像整個(gè)樣品。
與微芯片相關(guān)的一些重要限制：主要的限制之一是，如果需要進(jìn)行后續(xù)測(cè)試，細(xì)胞很難取回。此外，即使檢索到這些卷，其大小也可能不足以進(jìn)行后續(xù)測(cè)試。然而，為了適應(yīng)3D細(xì)胞培養(yǎng)市場(chǎng)的需求，即使是這些挑戰(zhàn)也正在與其他挑戰(zhàn)一起逐漸被克服。

9. 顯微鏡下3D細(xì)胞培養(yǎng)的未來
為了跟上藥物發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞治療市場(chǎng)日益增長(zhǎng)的需求，3D細(xì)胞培養(yǎng)面臨著許多挑戰(zhàn)。
第一個(gè)問題是重復(fù)性：通常情況下，3D細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果變化太大。這種可變性的來源有三個(gè)方面。第一個(gè)是生物學(xué)上的。眾所周知，細(xì)胞和細(xì)胞衍生產(chǎn)品(如Matrigel或血清)在不同批次的生產(chǎn)中存在廣泛差異?？勺冃缘牡诙€(gè)來源是基于用戶的：與3D細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的許多程序，如移液，都是手動(dòng)完成的，因此容易發(fā)生用戶依賴的可變性。最后，許多方案可能會(huì)受到環(huán)境因素的影響，而這些因素在分析中往往不是本地控制的，例如溫度或濕度，這可能會(huì)對(duì)3D凝膠聚合等關(guān)鍵步驟產(chǎn)生非常大的影響。與此同時(shí)，3D細(xì)胞培養(yǎng)程序遠(yuǎn)非易事。它們需要專業(yè)和訓(xùn)練有素的工作人員，而缺乏這些工作人員正在阻礙市場(chǎng)增長(zhǎng)。此外，這些任務(wù)既耗時(shí)又昂貴。
這些問題都指向了3D細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的兩大需求：自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。理想情況下，需要新的產(chǎn)品來促進(jìn)這些3D細(xì)胞培養(yǎng)過程并減少人為干預(yù)，從而將人為錯(cuò)誤降至最低，加快方案并提高吞吐量和重復(fù)性。細(xì)胞傳代或細(xì)胞擴(kuò)增等任務(wù)的自動(dòng)化已經(jīng)在進(jìn)行中。
3D細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的另一個(gè)主要瓶頸是缺乏方便的讀數(shù)。太多的研究嚴(yán)重依賴3D成像來分析細(xì)胞形態(tài)、遷移或生存能力。這需要大量的時(shí)間和使用昂貴的專業(yè)設(shè)備，如共焦顯微鏡。盡管考慮到這些變量的信息量很大，這仍然是必要的，但也需要努力開發(fā)更容易的讀數(shù)。與此同時(shí)，還需要努力標(biāo)準(zhǔn)化分析方法，以量化這些結(jié)果：重建3D圖像遠(yuǎn)非易事。雖然商業(yè)上有幾個(gè)3D重建軟件包，但從這些復(fù)雜的數(shù)據(jù)集中定義、提取和量化新的變量仍然是困難的。

總而言之，我們預(yù)計(jì)這些方法學(xué)上的挑戰(zhàn)將需要解決，以便在臨床背景下促進(jìn)3D細(xì)胞培養(yǎng)的流程化。這些技術(shù)進(jìn)步有望幫助該領(lǐng)域朝著以下方向發(fā)展：血管化、類器官/iPS細(xì)胞、芯片上器官、個(gè)性化醫(yī)學(xué)和免疫活性模型。
人們對(duì)血管化的細(xì)胞模型非常感興趣。首先，這大大增加了它們與藥物發(fā)現(xiàn)目的的生理相關(guān)性。事實(shí)上，許多疾病和生物過程與血管系統(tǒng)的存在、破壞或形成密切相關(guān)。例如，癌細(xì)胞在從原發(fā)腫瘤遷移并在遠(yuǎn)處器官中形成繼發(fā)腫瘤時(shí)與血管系統(tǒng)發(fā)生嚴(yán)重的相互作用。在體外對(duì)血管系統(tǒng)進(jìn)行建模也有助于通過血液循環(huán)重建藥物輸送。其次，出于細(xì)胞治療的目的，血管化組織將有更高的機(jī)會(huì)長(zhǎng)期植入患者體內(nèi)。
正如前面所討論的，另一個(gè)日益引起人們興趣的領(lǐng)域是有機(jī)化合物的使用。目前的努力在于使它們的制作方案標(biāo)準(zhǔn)化，但也有必要使它們血管化，原因如前所述。
芯片上的器官在藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域引起了人們的極大興趣，在過去的幾十年里，許多學(xué)術(shù)團(tuán)體開創(chuàng)了這一領(lǐng)域的先河。緩慢但肯定的是，許多不同器官的原型正在出現(xiàn)，這項(xiàng)技術(shù)現(xiàn)在正朝著同時(shí)集成幾個(gè)相互關(guān)聯(lián)的器官的芯片方向發(fā)展，以模仿更系統(tǒng)、更完整的模型。這些模型可能成為測(cè)試藥物和構(gòu)成細(xì)胞植入物的生物材料的細(xì)胞毒性的替代品。
所有這些發(fā)展都是在更普遍的個(gè)性化醫(yī)學(xué)范式轉(zhuǎn)變下出現(xiàn)的。個(gè)性化醫(yī)學(xué)傾向于開發(fā)針對(duì)患者自己的細(xì)胞定制的治療和診斷工具。換句話說，現(xiàn)在人們認(rèn)為，在不久的將來，可以從每個(gè)患者身上提取細(xì)胞，并將其整合到本綜述中描述的任何一種3D細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中，以便在體外重建患者自己的組織。
最后，我們預(yù)計(jì)免疫活性模型將成為3D細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的關(guān)鍵發(fā)展?，F(xiàn)在越來越清楚的是，免疫細(xì)胞在許多疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，實(shí)際上可以直接作為幫助患者的手段。癌癥免疫療法的成功證明了這一點(diǎn)，這種療法可以重新教育免疫細(xì)胞，使其更好地識(shí)別和抗擊癌癥。因此，將免疫細(xì)胞包括在3D體外細(xì)胞模型中將變得至關(guān)重要，以更好地了解它們的作用并篩選可以針對(duì)它們的藥物。有趣的是，一項(xiàng)研究表明，許多在老鼠身上有效的藥物在人類身上產(chǎn)生了不可預(yù)見的副作用，因?yàn)樗鼈兙哂忻庖咭种谱饔?。因?yàn)樗鼈兿魅趿嗣庖呦到y(tǒng)，機(jī)會(huì)性病原體成為患者感染的原因。因此，臨床前模型應(yīng)該包括免疫細(xì)胞來預(yù)測(cè)患者免疫抑制的風(fēng)險(xiǎn)。免疫系統(tǒng)也是生物材料植入后經(jīng)常引發(fā)的炎癥的罪魁禍?zhǔn)住⒚庖呒?xì)胞納入體外模型將有助于更好地預(yù)測(cè)生物材料引起有害反應(yīng)的可能性。
有趣的是，這項(xiàng)研究揭示了免疫抑制藥物往往與人類的毒副作用有關(guān)，這不僅揭示了免疫細(xì)胞，也揭示了病原體。換句話說，雖然這些藥物也會(huì)抑制老鼠的免疫系統(tǒng)，但老鼠身上的病原體與人類的不同。對(duì)于那些根據(jù)自己的情況或治療而可能擁有獨(dú)特微生物群的患者來說，情況尤其如此。因此，一個(gè)理想的藥物測(cè)試體外模型也可以包含人類病原體，以預(yù)測(cè)與藥物治療相關(guān)的感染。
對(duì)于所有這些3D細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展，最大的挑戰(zhàn)將在于檢測(cè)驗(yàn)證。事實(shí)上，人們需要驗(yàn)證體外數(shù)據(jù)的相關(guān)性和有效性，并將它們與體內(nèi)結(jié)果進(jìn)行比較。首先，這意味著我們需要為廣泛的疾病識(shí)別相關(guān)的生物標(biāo)記物，我們可以在體外模型和人類臨床數(shù)據(jù)之間進(jìn)行比較。其次，需要努力尋找可以與體外模型進(jìn)行比較的人類臨床數(shù)據(jù)。雖然如此多的挑戰(zhàn)很可能會(huì)通過無數(shù)的社會(huì)和技術(shù)改進(jìn)來解決，但我們認(rèn)為微流控芯片可能是解決我們提出的幾個(gè)問題的一個(gè)有前途的途徑。

10. 微流控可以做些什么？

首先，微流控技術(shù)在自動(dòng)化和加速繁瑣的桌面程序方面已經(jīng)顯示出巨大的潛力。例如，一些微流控芯片具有自動(dòng)化的ELISA協(xié)議，并且在將質(zhì)譜學(xué)結(jié)合到微流控芯片上進(jìn)行了大量的工作。這將成本和時(shí)間降至最低，但也通過最大限度地減少人為干預(yù)來幫助標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果。然而，向3D細(xì)胞的操作邁進(jìn)可能會(huì)被證明是更困難的。雖然在微流控工具中操縱流體是常規(guī)操作，但操縱和混合不同粘度的溶液(如細(xì)胞懸浮液和3D水凝膠)更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗枰惶自O(shè)備來克服層流流動(dòng)。
研究小組還找到了將微流控芯片與簡(jiǎn)單讀數(shù)相結(jié)合的方法。例如，懷特賽德小組已經(jīng)開發(fā)了基于紙張的比色微流控技術(shù)，這樣只需通過顏色變化就能顯示出檢測(cè)結(jié)果。微流控芯片在促進(jìn)個(gè)性化藥物方面也具有明顯的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈冃枰倭康募?xì)胞，因此這些細(xì)胞可能都來自患者。
與此同時(shí)，已經(jīng)在努力開發(fā)具有受控環(huán)境的微流控芯片，就像生物反應(yīng)器一樣。例如，重新創(chuàng)造低氧環(huán)境的微流控工具已經(jīng)被創(chuàng)造出來，以模擬癌癥組織中的低氧。在另一項(xiàng)研究中，微流控芯片被連接到壓力控制器，以對(duì)細(xì)胞施加周期性壓力和壓力，就像它們?cè)诜沃兴?jīng)歷的那樣。換句話說，微流控芯片可以成為自己的微型生物反應(yīng)器，從而獲得我們已經(jīng)討論過的生物反應(yīng)器為3D細(xì)胞培養(yǎng)提供的許多好處。與此同時(shí)，具有集成傳感器的微流控技術(shù)正在開發(fā)中，并且很可能在不久的將來變得更加普遍。傳感器的存在，就像在生物反應(yīng)器中一樣，能夠監(jiān)測(cè)重要的變量，并促進(jìn)自動(dòng)化和可追蹤性。
微流體實(shí)現(xiàn)的自動(dòng)化、小型化和精確化也將有助于標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞分化等敏感程序。事實(shí)上，需要分化的細(xì)胞，如干細(xì)胞或單核細(xì)胞，通常使用常規(guī)的宏觀體外實(shí)驗(yàn)程序進(jìn)行分化，如果不控制化學(xué)和環(huán)境刺激，這種方法可能容易出現(xiàn)很大的變異。相比之下，微流控芯片可以精確控制培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送，或氧氣濃度或流體性質(zhì)，所有這些都已被證明影響干細(xì)胞分化。同時(shí)，將這些芯片與蛋白質(zhì)分析等傳感器相結(jié)合，可以解開特定信號(hào)和信號(hào)通路在細(xì)胞分化過程中的作用。

微流控技術(shù)促進(jìn)的小型化和自動(dòng)化最終提供了將繁瑣的程序從科學(xué)中心分散到更偏遠(yuǎn)地區(qū)的可能性。這已經(jīng)被用于檢測(cè)肝功能的微流體。相比之下，微流控應(yīng)用于3D細(xì)胞培養(yǎng)目前需要許多步驟，而這些步驟只能在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。然而，隨著正在進(jìn)行的發(fā)展，3D細(xì)胞培養(yǎng)微流控也可能成為直接用于臨床的臨床點(diǎn)診斷方法，即使不是在偏遠(yuǎn)地區(qū)。
獨(dú)一無二的是，微流控芯片能夠?qū)ρ芙Y(jié)構(gòu)進(jìn)行灌流。簡(jiǎn)而言之，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞混合在適當(dāng)?shù)?/span>3D凝膠(如纖維蛋白)中時(shí)，它們就會(huì)形成血管。雖然這可以以任何形式發(fā)生，但微流控芯片中的血管形成直接連接到微流控通道的開口。這意味著人們可以通過微流體通道直接接觸到血管的血管內(nèi)隔間，從而使血管可以被顆粒、細(xì)胞或介質(zhì)灌流。這對(duì)于重建許多涉及細(xì)胞或分子在血管系統(tǒng)內(nèi)運(yùn)輸?shù)纳镞^程，或者僅僅是能夠在血管系統(tǒng)內(nèi)灌流藥物，就像它們將在患者體內(nèi)輸送一樣，是至關(guān)重要的。另一方面，有機(jī)類化合物也可以在微流控芯片中生長(zhǎng)，以更好地控制它們的發(fā)展。也就是說，微流體室將在一定程度上限制并控制有機(jī)物的形狀和大小。最終，有機(jī)化合物可以與微流控芯片中的血管網(wǎng)絡(luò)混合，獲得可灌流的器官模型，并獲得更復(fù)雜的組織模型。最終，在微流控芯片中結(jié)合干細(xì)胞/有機(jī)體意味著能夠使用患者來源的細(xì)胞來創(chuàng)建個(gè)性化的細(xì)胞模型。
同時(shí)，微流控系統(tǒng)特別適合免疫細(xì)胞的研究，正如在其他地方廣泛回顧的那樣。這是因?yàn)樗鼈冊(cè)试S建立細(xì)胞因子梯度，這是免疫細(xì)胞的重要指導(dǎo)信號(hào)。微流體模型提供的流量控制對(duì)于重建血液循環(huán)中的免疫細(xì)胞傳輸至關(guān)重要。同樣，前面討論的在微流控芯片上灌流血管的能力也特別有助于重建免疫細(xì)胞在血管內(nèi)和血管間的運(yùn)輸，就像它們?cè)隗w內(nèi)所做的那樣。最后，免疫細(xì)胞是高度流動(dòng)性和異質(zhì)性的細(xì)胞，這必須經(jīng)常被視作研究它們的一種手段。微芯片極大地方便了他們進(jìn)行詳細(xì)分析的高分辨率成像。
最后，微芯片一直是芯片器官騰飛努力背后的唯一技術(shù)。正如我們之前所討論的，微芯片提供的對(duì)微環(huán)境的更多控制使得這項(xiàng)技術(shù)成為開發(fā)有機(jī)模式的獨(dú)特技術(shù)。此外，流動(dòng)的促進(jìn)使所述器官之間能夠連接和相互作用，以及分子從一個(gè)器官到另一個(gè)器官的運(yùn)輸。這些相互作用已被證明是藥物測(cè)試的關(guān)鍵。例如，腸道和肝臟被結(jié)合在芯片上，因?yàn)樗幬锸紫韧ㄟ^腸道吸收，然后由肝臟代謝。它們的結(jié)合已經(jīng)被證明對(duì)藥物命運(yùn)的影響不同于單獨(dú)培養(yǎng)腸道肝臟的芯片。在芯片上添加胃可能對(duì)模擬胃排空也很重要，所有這些都會(huì)影響藥物的藥代動(dòng)力學(xué)。最終，人們可以想象一種芯片上的身體產(chǎn)品，其中基本的器官型組織通過可灌流的血管系統(tǒng)相互連接，以測(cè)試人體對(duì)藥物的全身反應(yīng)。
最近，研究人員首次在芯片上以3D生物打印心臟：這顯示出促進(jìn)和標(biāo)準(zhǔn)化芯片上器官制造的巨大希望。此外，軟應(yīng)變傳感器被集成到組織的微體系結(jié)構(gòu)中，為芯片上的儀器器官鋪平了道路。
總而言之，我們相信，如果有真正的努力將其潛力從學(xué)術(shù)環(huán)境轉(zhuǎn)化為臨床世界，微流控技術(shù)將為3D細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域提供很大的幫助。最有可能的是，解決方案不僅將借鑒微流控技術(shù)，還將借鑒水凝膠和生物反應(yīng)器技術(shù)的進(jìn)步，最終融入一個(gè)協(xié)同領(lǐng)域。然而，所有這些都需要工程師、生物學(xué)家、臨床醫(yī)生、衛(wèi)生監(jiān)管機(jī)構(gòu)…之間的共同努力。所以，讓我們一起努力吧！