前言

在過去的數(shù)十年間，人們通常是將一群細(xì)胞中的每個(gè)細(xì)胞都視為相同的細(xì)胞進(jìn)行研究的。但是，對(duì)這群相同基因的研究往往會(huì)忽視掉每一個(gè)細(xì)胞的特征。因?yàn)榧词故窃趽碛型瑯蛹?xì)胞經(jīng)歷的細(xì)胞種群里，在轉(zhuǎn)錄或翻譯以及信號(hào)通路的噪聲方面，也存在著隨機(jī)波動(dòng)，會(huì)形成內(nèi)在的異質(zhì)性。這些在看似由相同細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞種群里隱藏著的細(xì)胞-細(xì)胞之間的變異也許對(duì)疾病的產(chǎn)生和治療有著重要的意義。例如腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性在理解腫瘤的誘發(fā)、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移與治療應(yīng)答方面就有著重要作用。在臨床前藥物研研發(fā)過程中，極小比例的一群細(xì)胞亞型也許會(huì)導(dǎo)致腫瘤的抗性，它些細(xì)胞亞型也許與腫瘤患者治療后的復(fù)發(fā)有關(guān)。因此，隨著藥物變得越來越個(gè)性化，我們有更強(qiáng)的動(dòng)機(jī)來更加準(zhǔn)確地表示和理解單細(xì)胞以及這些不同的細(xì)胞亞型。對(duì)于細(xì)胞異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)已經(jīng)激發(fā)了人們對(duì)單細(xì)胞組學(xué)研究的熱情，這些組學(xué)包括基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)及其內(nèi)在的相互作用。

傳統(tǒng)的激光共聚焦，流式和質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)被廣泛地運(yùn)用到了單細(xì)胞水平的分析上。但是，共聚焦方法存在著局限，例如低通量，成本高，因此在對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行全局化分析，以及發(fā)現(xiàn)新型細(xì)胞亞型特征方面，使用這些技術(shù)并不現(xiàn)實(shí)。而流式細(xì)胞術(shù)則有著高通量的特點(diǎn)（每秒1000個(gè)細(xì)胞），但也有著局限，其中的局限就是，在流式分析過程中，細(xì)胞會(huì)受到物理作用，這些物理作用包括流體壓力，激光束照射，靜電壓，高電場(chǎng)，以及與容器壁相撞，這些因素都會(huì)影響細(xì)胞的收率與完整性。雖然前面提到的這些技術(shù)都能確定細(xì)胞表型，但是是流式細(xì)胞儀中采用的抗體是基于先驗(yàn)知識(shí)，它限制了一些新細(xì)胞亞型的發(fā)現(xiàn)。此外，這些方法所需的細(xì)胞數(shù)目大概是100萬，同時(shí)它無法檢測(cè)細(xì)胞隨時(shí)間變化的代謝變化。而流式抗體的熒光光譜也限制了流式抗體的使用數(shù)目，使用參數(shù)過少。為了解決傳統(tǒng)的流式問題，有人開發(fā)了基于質(zhì)譜與流式的質(zhì)譜流式細(xì)胞儀，它能使用超過40個(gè)通道的參數(shù)。質(zhì)譜流式的原理就是，使用重金屬（這些重金屬并不存在于人體內(nèi)，主要是稀有金屬）來標(biāo)記抗體。但這種技術(shù)還是無法檢測(cè)細(xì)胞的代謝活動(dòng)，只能靜態(tài)地檢測(cè)細(xì)胞特征。由于質(zhì)譜檢測(cè)器的低靈敏性，質(zhì)譜流式無法檢測(cè)那些低水平表達(dá)的細(xì)胞特征。并且一次分析的數(shù)目也有上限。

為解決上述問題，以微芯片為基礎(chǔ)的單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。微芯片技術(shù)就是通過在微觀層面形成一個(gè)個(gè)的分析區(qū)室，這個(gè)區(qū)室與一個(gè)細(xì)胞的大小接近，而樣本的收集時(shí)間與反應(yīng)時(shí)間也會(huì)縮短，同時(shí)還具備高通量的特征。此外，微芯片是在層流狀態(tài)下運(yùn)行的，環(huán)境穩(wěn)態(tài)，因此可以在單細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)更加精確、更加靈敏的檢測(cè)。微芯片技術(shù)也為自動(dòng)化，一體化，平行化提供了平臺(tái)，進(jìn)而能節(jié)省人力物力，促進(jìn)單細(xì)胞層面上的研究。

在Figure 1中我們就能看到微芯片技術(shù)在單細(xì)胞層面上的基因組學(xué)、表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)。

基因組

遺傳突變會(huì)導(dǎo)致生物體基因的多樣性，而全基因組測(cè)序可以發(fā)現(xiàn)基因組上的突變，結(jié)構(gòu)變異，非整倍體變化以及重組。但是一個(gè)細(xì)胞的基因組(gDNA)太小，在進(jìn)行測(cè)序之前必須要進(jìn)行擴(kuò)增?，F(xiàn)在通常采用PCR或異位多重置換擴(kuò)增反應(yīng)(MDA,isothermal multiple displacement amplification)來對(duì)單一細(xì)胞的整個(gè)基因組進(jìn)行擴(kuò)增。但這兩種技術(shù)會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增偏倚，例如無法均一覆蓋整個(gè)基因組，產(chǎn)生嵌合DNA，堿基復(fù)制錯(cuò)誤，假陽性，假陰性以及等位基因丟失(ADO，allelic dropouts)等。簡并寡核苷酸引物PCR(Degenerate-oligonucleotide-primed PCR)以及多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增(MALBAC，multiple annealing and loop-based amplification cycling)可以改善單細(xì)胞全基因組的擴(kuò)增效果。雖然這兩種方法比MDA有著更好的均一性，但是缺乏對(duì)全基因組，長鏈DNA產(chǎn)物的覆蓋，以及對(duì)單核苷酸的突變檢測(cè)能力低。MDA除了有擴(kuò)增不均一以及擴(kuò)增偏倚這種缺點(diǎn)外，它還有其它的一些局限，例如假性引物的相互作用（引物二聚體或DNA污染）來源的非特異性合成。因此，在單細(xì)胞全基因組測(cè)序領(lǐng)域仍然需要高度均一性以及高保真的擴(kuò)增方法用于精確地識(shí)別indel，CNV，SNV，結(jié)構(gòu)變異等。

為了改善單細(xì)胞WGA的擴(kuò)增均一性以及減少擴(kuò)增偏倚，微流控技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。微流控技術(shù)能將反應(yīng)體系從微升級(jí)(microliter)降低到納升級(jí)(nanoliter)甚至皮升級(jí)(picoliter)，此項(xiàng)技術(shù)能最大程度地降低外源DNA的污染以及交叉污染。因?yàn)樵谖⒘骺貐^(qū)室中，每個(gè)區(qū)室中含有級(jí)少量的DNA片段，這樣在DNA模板，引物與聚合酶之間的競爭就會(huì)降低。微流控技術(shù)還能改善反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特異以及提高擴(kuò)增的效率，因此能夠大大降低擴(kuò)增偏倚。此外微流控技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)大量單細(xì)胞的平行高通量分析。

微流控技術(shù)的典型形態(tài)特征就是閥門，納米孔(nanowell），微滴。通過將反應(yīng)體系降低到納升級(jí)，基于閥門的微流控硬件系統(tǒng)就會(huì)捕獲一個(gè)大腸桿菌(Escbericbia coli)細(xì)胞，并擴(kuò)增它的gDNA，一次就能同時(shí)處理9個(gè)樣本，如Figure2所示。這種策略能夠減少試劑用量，降低實(shí)驗(yàn)成本，改善擴(kuò)增特異性（高達(dá)95%）。由于反應(yīng)體系少，假性引物相互作用，DNA模型合成的非特異性，以及擴(kuò)增偏倚都會(huì)降低。

我們將這種微流控系統(tǒng)的思路往前再推進(jìn)一步，那么就可以在96孔板中同時(shí)對(duì)96個(gè)細(xì)胞進(jìn)行捕獲，裂解，擴(kuò)增。這種系統(tǒng)可以整合流體回路，形成大量的納升級(jí)反應(yīng)體系。由于其高通量的特異，每個(gè)細(xì)胞都能產(chǎn)生約150-250ng的DNA，對(duì)一個(gè)細(xì)胞也能實(shí)現(xiàn)多重分析，實(shí)現(xiàn)靶向重測(cè)序，全外顯子測(cè)序（WES）與WGS。微流控系統(tǒng)能夠改善均一性，實(shí)現(xiàn)低ADO率，以及更小的單核苷酸錯(cuò)誤。

微流控的平臺(tái)還能降低反應(yīng)體系，改善WGA的均一性（figure2b）。這種方法可以在數(shù)千個(gè)固定的納升反應(yīng)室中實(shí)現(xiàn)大量平行的DNA擴(kuò)增。這種方法能實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的高度覆蓋，并且在從頭組裝基因組方面也有著極大的改善，它能夠檢測(cè)出一個(gè)成人神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)微的體細(xì)胞CNV。有報(bào)道指出，微流控系統(tǒng)能夠覆蓋大腸桿菌88-94%的基因組。

雖然閥門與微孔技術(shù)常常用于多步單細(xì)胞反應(yīng)，但是精密加工與微流控的控制技術(shù)還存在著一些技術(shù)瓶頸，這些技術(shù)瓶頸限制了最大的樣本加工能力。不過現(xiàn)在這些問題已經(jīng)通過液滴微流控技術(shù)得到了解決。這些技術(shù)可以將單一細(xì)胞的gDNA片段分散到大量的皮克級(jí)液滴中，在擴(kuò)增中，降低試劑與DNA片段的競爭，因此會(huì)在保持高度精確性的同時(shí)，避免擴(kuò)增偏倚（figure2 c）。例如，基因組的覆蓋范圍是59-89%，SNV的錯(cuò)誤率是在20萬分之1以下，使用基于液滴的方法可以降低那些擴(kuò)增中的復(fù)制錯(cuò)誤。不過，這些平臺(tái)在進(jìn)行下流的WGA分析之前，它們分離與選擇單一細(xì)胞要么是手動(dòng)的，要么是FACS途徑。為了進(jìn)一步提升通量，單一液滴MDA(sd-MDA)被開發(fā)了出來，這種sd-MDA技術(shù)通過一對(duì)一的液滴融合，在微流控的管道中，將MDA的試劑加入到已經(jīng)包裹的單一細(xì)胞液滴中。此技術(shù)能夠在1小時(shí)內(nèi)，1次處理幾萬個(gè)細(xì)胞，同時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)每一個(gè)反應(yīng)小室中更高的均一性與試劑分配，降低樣本與試劑損耗。sd-MDA技術(shù)可以更高范圍地覆蓋細(xì)菌與哺乳動(dòng)物整個(gè)基因組，并降低污染。

雖然傳遞的微流控方法使用的是一些例如閥門，納米板與液滴技術(shù)，但是一些新的設(shè)計(jì)已經(jīng)用于改進(jìn)WGA。一種無閥門微流控設(shè)計(jì)已經(jīng)可以通過微柱陣列（GAMA，micropillar array）來實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞基因組擴(kuò)增。當(dāng)單細(xì)胞被芯片捕獲，并裂解后，微柱就能捕獲gDNA， 而其它成分，例如單細(xì)胞的線粒體就被沖走。純化的gDNA隨后就通過MDA進(jìn)行擴(kuò)增，整個(gè)過程在一個(gè)穩(wěn)定的微流環(huán)境下進(jìn)行，因此擴(kuò)增產(chǎn)生會(huì)被沖到下游的儲(chǔ)存室，用于分析。通過基因位點(diǎn)采樣（gene loci sampling）與WES就能比較基于GAMA或基于FACS方法的實(shí)現(xiàn)的基因覆蓋。與FACS技術(shù)相比，在微流孔中能夠?qū)崿F(xiàn)更高的基因組覆蓋，以及更低的擴(kuò)增偏倚。

為了解決傳統(tǒng)復(fù)雜的微流控步驟與芯片平臺(tái)的精密加工問題，大量的聚乙二醇水凝膠已經(jīng)用作微流控平臺(tái)來大量平行地檢測(cè)MDA。通過形成一個(gè)孔徑25nm的凝膠基質(zhì)，細(xì)胞與DNA模板由于在這種凝膠中分散程度有限，它們就能形成區(qū)室。最終，這些擴(kuò)增的產(chǎn)物就會(huì)局限在這些區(qū)室中，并且能夠最大程度地降低外源DNA的污染與交叉污染。這種方法能夠覆蓋大腸桿菌（E.coli）細(xì)胞基因組的30%，以及覆蓋金黃色釀膿葡萄球菌（Staphylococcus aureus）基因組的60%，其中只有0.5%的嵌合reads。

表觀基因組

表觀遺傳學(xué)研究的是同基因細(xì)胞內(nèi)的功能基因組元件和它們的調(diào)控變化，這些調(diào)控變化能導(dǎo)致不同的基因表達(dá)差異。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化，組蛋白修飾與染色質(zhì)組裝和染色體形成，它們?cè)诩?xì)胞行為多樣性，細(xì)胞發(fā)育和疾病方面有著重要的作用。在傳統(tǒng)研究中，我們通常會(huì)檢測(cè)細(xì)胞種群中的大部分細(xì)胞，這種檢測(cè)會(huì)隱藏表觀遺傳的異質(zhì)性，因此最好在單細(xì)胞水平上分析表觀基因組。此外，傳統(tǒng)方法對(duì)于那些低細(xì)胞數(shù)目的樣本并不敏感，并不能發(fā)現(xiàn)這些樣本中的固有的特征。最近發(fā)展的微流控技術(shù)則能夠?qū)渭?xì)胞進(jìn)行高通量、高靈敏地表觀遺傳學(xué)分析。

Buenrostro使用了基于閥門的微流控平臺(tái)開發(fā)了基于轉(zhuǎn)座酶的染色質(zhì)單細(xì)胞分析技術(shù)(scATAC-seq，single-cell assay for transposase-accessible chromatin)。使用這種技術(shù)，他們?cè)谝粋€(gè)集成的微流控芯片(integrated fluidics circuit，IFC)中捕獲并裂解了96個(gè)細(xì)胞。然后在芯片上進(jìn)行ATAC，隨后釋放，Tn5末端延伸，以及PCR。從IFC上收集了單細(xì)胞庫后，給每一個(gè)細(xì)胞加上條形碼(barcode)，隨后將單細(xì)胞庫混合起來進(jìn)行測(cè)序。使用這種方法，作者研究了254GM12878淋巴母細(xì)胞的DNA開合性(accessibility)，這些單細(xì)胞來源的數(shù)據(jù)顯示了整體檢測(cè)(bulk measurement）的相似性。此外，他們還估計(jì)了其它細(xì)胞系中數(shù)千的細(xì)胞的染色質(zhì)開合性。DNA甲基化是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳標(biāo)記，通過亞硫酸氫鹽將胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶就能檢測(cè)DNA的甲基化。單細(xì)胞亞硫酸氫鹽測(cè)序和簡化代表性重亞硫酸鹽測(cè)序(RRBS,Reduced representation bisulfite sequencing)能夠以人工低通量的方式實(shí)現(xiàn)。此外，一種結(jié)合MDA的甲基化特異性酶鑒別方法能夠?qū)崿F(xiàn)單細(xì)胞水平上的基因組表達(dá)譜與甲基化模式。這些方法都有可能被整合到微流控系統(tǒng)中。例如，基于微流控?cái)U(kuò)散的簡化代表性重亞硫酸鹽測(cè)序被開發(fā)出來用于檢測(cè)少量細(xì)胞的DNA甲基化，并被應(yīng)用于檢測(cè)小鼠小腦中原代神經(jīng)細(xì)胞和原代膠質(zhì)細(xì)胞的分化。

此外，Rotem還報(bào)道了使用液滴微流控技術(shù)用于分析了數(shù)千個(gè)單細(xì)胞的染色質(zhì)狀態(tài)。在這個(gè)裝置中，單細(xì)胞首選被區(qū)室化，然后裂解，并經(jīng)過微球菌核酸酶(Micrococcal Nuclease)處理。當(dāng)細(xì)胞被裂解后，染色質(zhì)被片段后，含有染色質(zhì)的液滴與DNA條形碼融合，標(biāo)記每個(gè)最初的細(xì)胞。最后，匯集所有的液滴并測(cè)序。使用這種平臺(tái)，一個(gè)混合了小鼠胚胎干細(xì)胞（ES）、胚胎成纖維細(xì)胞和造血干細(xì)胞的一團(tuán)細(xì)胞就能夠根據(jù)H3K4me2區(qū)室開來。源于數(shù)千的ES細(xì)胞的不同的染色質(zhì)標(biāo)簽也能用于確認(rèn)表觀遺傳的異質(zhì)性。

納米孔也有被報(bào)道用于高通量的scATAC-seq。在這種方法中，大規(guī)模平行的納米孔陣列被用于加載并分離單個(gè)細(xì)胞。然后，另入裂解液，轉(zhuǎn)位試劑(transposition reagent)，EDA，MgCl2，以及PCR試劑。為了確保數(shù)據(jù)是來源于單個(gè)細(xì)胞，分離的單的細(xì)胞還要進(jìn)行熒光染色。這種方法能夠?qū)崿F(xiàn)高通量（每張芯片1800個(gè)細(xì)胞），短時(shí)間（4到5小時(shí)）與低成本（一個(gè)細(xì)胞不到1美元）的單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)測(cè)序。通過這種平臺(tái)，有人報(bào)道了基于表觀表達(dá)譜的人類外周血中的不同細(xì)胞類型。

轉(zhuǎn)錄組

轉(zhuǎn)錄組，尤其是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組為我們提供了基因表達(dá)模式的思路，基因的表達(dá)模式反應(yīng)了細(xì)胞的異質(zhì)性。轉(zhuǎn)錄組是由一系列的mRNA轉(zhuǎn)錄本構(gòu)成。當(dāng)內(nèi)部或外部對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響后，例如細(xì)胞的分化狀態(tài)或外部的環(huán)境應(yīng)激，單細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜就會(huì)快速地發(fā)生變化。因此，這些mRNA的變化攜帶了有關(guān)細(xì)胞類型和狀態(tài)的豐富的生物信息。為了更加全面地理解在細(xì)胞種群與組織中，不同細(xì)胞的狀態(tài)和亞型，有必要來研究轉(zhuǎn)錄組。

在單細(xì)胞層面上確認(rèn)和定量轉(zhuǎn)錄組的挑戰(zhàn)就是，單細(xì)胞的RNA量很少，只有皮克級(jí)。此外，這些少量的RNA在經(jīng)過不充分的反轉(zhuǎn)錄后，以及低效率的擴(kuò)增后，那些低豐度的轉(zhuǎn)錄本會(huì)丟失，從而產(chǎn)生偏倚。此外，RNA分子的易揮發(fā)和降解進(jìn)一步降低了轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量，增加了信號(hào)的噪聲，損失了檢測(cè)了精確與可重復(fù)性。為了能夠區(qū)分不同細(xì)胞的類型或狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)罕見的細(xì)胞亞型，降低技術(shù)偏差和內(nèi)在噪聲的影響，因此有必要進(jìn)行高通量的單細(xì)胞表達(dá)譜研究。然而，在精確與快速的樣本操作與分離方面面臨著挑戰(zhàn)?；谖⑿酒墓ぞ咄ㄟ^克服上述局限，它能夠利用少量的RNA，在納升反應(yīng)室中對(duì)其進(jìn)行處理，并能降低污染，減少試劑消耗，提高捕獲效率。微流控平臺(tái)的小型化與并行化提供了更簡潔，更靈活的單細(xì)操作方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的高通量和低成分的分析方法。

常用的轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)包括RNA熒光原位雜交（RNA-FISH），定量PCR（qPCR）與mRNA-seq。FISH是一種檢測(cè)并定位一個(gè)細(xì)胞中mRNA的有效方法。利用時(shí)序FISH(sequential FISH)和超分辨成像技術(shù)，可以檢測(cè)單細(xì)胞中的數(shù)萬個(gè)mRNA。Matsunaga等人開發(fā)了一種微流控裝置，可以通過FISH技術(shù)來檢測(cè)多達(dá)100個(gè)單細(xì)胞。作者使用采用優(yōu)化了空腔尺寸的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯的微網(wǎng)，能夠在短時(shí)間內(nèi)高效率地捕獲細(xì)胞。此設(shè)備成功地區(qū)分了不同細(xì)胞種群中的mRNA的表達(dá)水平，并使用FISH檢測(cè)了單細(xì)胞水平上的β-actin。Kao等人開發(fā)了另外一種整合FISH微流控平臺(tái)用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞系中的HER2，此平臺(tái)包含一種全自動(dòng)化的FISH程序，如Figure3所示。通過使用微泵和微閥，在同一個(gè)設(shè)備中可以集成多個(gè)功能，從而DNA探針的使用和操作時(shí)間就會(huì)減少。同時(shí)試劑消耗也會(huì)降低70%。

此外，RT-qPCR廣泛用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，它用于定量基因表達(dá)水平的差異。該技術(shù)有著高靈敏度、高特異性和極大范圍的線性，并已經(jīng)用于單細(xì)胞基因表達(dá)分析，不過在常規(guī)系統(tǒng)里，它并不可靠。Eastburn使用了一個(gè)基于液滴的微流控裝置，報(bào)道了一次運(yùn)行中的5萬個(gè)單細(xì)胞的RT-PCR（Figure 3e）。使用這種方法可以從混合的細(xì)胞群體中高度特異性地挑出目的細(xì)胞，這表明該方法在稀有細(xì)胞的分析中有著應(yīng)用潛力。液滴微流控平臺(tái)也表現(xiàn)出了對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的高通量分選能力。FISH和RT-PCR平臺(tái)的缺點(diǎn)在于它們采用的是相對(duì)定量的方法，在一次實(shí)驗(yàn)中，它們只能對(duì)已知的基因的數(shù)目進(jìn)行檢測(cè)。因此，這些方法無法從一個(gè)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)全局的信息。這些方法還依賴于我們對(duì)目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的先驗(yàn)知識(shí)，從而阻礙了新基因的發(fā)現(xiàn)。

為了克服FISH和RT-PCR平臺(tái)的局限性，單細(xì)胞RNA測(cè)序現(xiàn)在已經(jīng)成為了分析基因表達(dá)異質(zhì)性的重要工作。這種廣泛應(yīng)用的方法使能夠以一種客觀及無偏的方式在整個(gè)轉(zhuǎn)錄本水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。在對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分離和裂解后，mRNA被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增（WTA，whole-transcriptome amplification），最終進(jìn)行測(cè)序。兩種常見的生成cDNA的方式就是oligod(T)錨定和模板轉(zhuǎn)換法(template-switching)。但是oligo-d(T) 錨定法會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的mRNA偏倚，因此這種方法對(duì)3‘末端有著偏好。模板轉(zhuǎn)換法則解決這個(gè)問題，這種方法采用了MMVLRT酶(MMVLRT全稱是Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase，即莫洛尼鼠類白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶)，這種酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性以及模板轉(zhuǎn)移能力。因此，非模板胞嘧啶殘基可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加到cDNA的3’末端。這種方法就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)多聚鳥苷模板和銜接序列(adaptor sequence)，此序列可以使MMLVRT產(chǎn)生一個(gè)包含完整5'末端的mRNA的全長的cDNA轉(zhuǎn)錄本。這兩種方法都通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。獨(dú)特分子標(biāo)簽(UMI，Unique molecular identifiers)通常用于在WTA之前對(duì)每個(gè)原始mRNA進(jìn)行標(biāo)記，通過下游對(duì)原始數(shù)據(jù)的均一化和質(zhì)控能夠降低擴(kuò)增偏倚。擴(kuò)增后的cDNA文庫被加上條形碼，隨后混合，使用NGS進(jìn)行測(cè)序。

如上所述，基于閥門的方法通量比較低，并且非常耗時(shí)，還需要專業(yè)的工程學(xué)知識(shí)。盡管存在著這些缺點(diǎn)，基于閥門的方法也由于其高度可控性而被廣泛使用。Street設(shè)計(jì)了一種RNA測(cè)序微流控裝置，用于在芯片上捕獲，裂解以及逆轉(zhuǎn)錄單細(xì)胞(figure3b)，并且在此芯片上，還能完成polyA加尾，引物消化以及第二鏈cDNA的合成。同時(shí)，該芯片還能實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，純化，文庫制備和測(cè)序工作，使用此技術(shù)從10個(gè)小鼠的胚胎單個(gè)細(xì)胞中獲取了高質(zhì)量的cDNA，以及在每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到了8000個(gè)基因。使用這種方法還發(fā)現(xiàn)了小鼠骨髓來源的樹突細(xì)胞，小鼠大腦細(xì)胞以及人類大腦細(xì)胞的多樣性。但是通過一些手段，例如控制軟件，則能夠增加通量，降低操作時(shí)間，這樣就能最大程度地提高基于閥門的裝置的利用。這項(xiàng)研究表明，將以前基于手動(dòng)的閥門微流控進(jìn)行自動(dòng)化后，就能夠極大地提高通量與加工效率。KATARA(全稱為Kit for Arduino-based Transistor Array Actuation)也引入了一個(gè)帶圖形用戶界面的python包，因此這種操作并不需要太專業(yè)的硬件知識(shí)。

此外，基于微孔的方法能夠減少對(duì)專業(yè)設(shè)備的需要，降低未利用到的體積，并有利于實(shí)現(xiàn)并行化操作，從而能夠提供更高的可擴(kuò)展性和簡并性(Figure3c)。細(xì)胞培養(yǎng)與成像系統(tǒng)也能與微孔平臺(tái)兼容。Seq-Well是一種用于單細(xì)胞RNA測(cè)序的低成本，可移植和大規(guī)模平行測(cè)序的平臺(tái)。這種平臺(tái)可以通過重力以及加了條形碼的poly(dT)來捕獲單細(xì)胞，最終能夠?qū)⒓?xì)胞分散在86000個(gè)亞納米孔中。由于每個(gè)納米孔只能容下一顆微珠，裝載效率高達(dá)95%。納米孔是用于半滲透碳酸酯薄膜密封的，而非礦物油。這種膜可以在細(xì)胞裂解過程中進(jìn)行溶液交換，同時(shí)還能捕獲生物大分子，能夠更好地捕獲mRNA，并最大限度地降低交叉污染。當(dāng)裂解，捕獲mRNA后，就開始反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增，文庫制備，雙端測(cè)序。這個(gè)硬件已經(jīng)成功地用于研究暴露于結(jié)核分枝桿菌后的數(shù)千個(gè)原代人類巨噬細(xì)胞。

基于液滴的方法為單細(xì)胞RNA測(cè)序提供了可擴(kuò)展性，其本身也具有大規(guī)模平行測(cè)序的特點(diǎn)。這類方法主要的平臺(tái)就是Drop-seq與InDrop平臺(tái)，它們利用微流控硬件將單個(gè)細(xì)胞人、試劑和加有條形碼的微球或水凝膠微球封閉在油滴中（Figure 3d）。這些條形碼由一個(gè)PCR引物，一個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞編碼，一個(gè)UMI構(gòu)成，它們用于區(qū)分捕獲的mRNA，而poly(T)用于與多聚腺苷酸產(chǎn)mRNA結(jié)合。裂解、反轉(zhuǎn)染和PCR都是在液滴中進(jìn)行的。因此這些反應(yīng)被限制在液滴中，而最終擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄本含有獨(dú)特的標(biāo)簽，因此這些平臺(tái)可以將所有的液滴匯集起來，方便了液滴乳化后的后續(xù)處理過程以及文庫制備。當(dāng)測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到一個(gè)參考基因組后，就可以通過一個(gè)數(shù)字基因表達(dá)矩陣進(jìn)行組裝，再根據(jù)細(xì)胞上的標(biāo)簽來區(qū)分每個(gè)細(xì)胞，使用UMI來對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量。使用這種方法已經(jīng)研究了大量的小鼠ES細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞，提示了詳細(xì)的群體結(jié)構(gòu)和新的候選細(xì)胞亞型。雖然這些設(shè)備可以低成本地每小時(shí)處理數(shù)以萬計(jì)的細(xì)胞，但是在液滴形成過程中，由于控制較少，因此會(huì)導(dǎo)致封裝效率低下。此外，由于mRNA捕獲效率比較低，這就是限制了這種方法對(duì)于那些低表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)。當(dāng)處理含有少量細(xì)胞的小樣本時(shí)，這種方法就會(huì)顯得力不從心。此外，這種方法還需要其他附加設(shè)備，因此限制了其它不同實(shí)驗(yàn)室的使用。

包括miRNA在內(nèi)的小RNA在調(diào)控異質(zhì)性細(xì)胞種群中發(fā)揮著重要作用。miRNA是一類小的非編碼RNA，它們?cè)谠S多生物系統(tǒng)中能調(diào)控基因的表達(dá)。在細(xì)胞中，miRNA可以通過與mRNA互補(bǔ)來調(diào)控mRNA的表達(dá)，從而誘導(dǎo)mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯?，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了一些基于微芯片的技術(shù)來對(duì)miRNA進(jìn)行定量分析。White等人開發(fā)了一種帶有可控氣動(dòng)閥門的微流控裝置用于檢測(cè)單細(xì)胞的miRNA表達(dá)，此裝置還整合了從細(xì)胞捕獲到qPCR的所有處理步驟。該平臺(tái)一次運(yùn)行能夠檢測(cè)300個(gè)細(xì)胞，同時(shí)還能將試劑的消耗降低1000倍。還有人開發(fā)了一種流動(dòng)FISH微芯片來檢測(cè)以及定位miRNA。通過這種方法，Wu等人以可視化的方式展現(xiàn)了由離子霉素誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞中CD69和miR-155的表達(dá)，并同時(shí)對(duì)PMA進(jìn)行了定量。Guo等人開發(fā)了一種連續(xù)流動(dòng)的微流控裝置，此裝置使用DNA雜交的方式擴(kuò)增了目標(biāo)miRNA的信號(hào)，這是一種非PCR式的miRNA分析方法。這種分析方法能夠在油包水的液滴中分離細(xì)胞，此液滴中還含有DNA擴(kuò)增子。當(dāng)細(xì)胞裂解后，miRNA就會(huì)與DNA擴(kuò)增子相互作用引發(fā)雜交反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號(hào)，并循環(huán)產(chǎn)生最初的靶向序列。這種循環(huán)開啟了一個(gè)循環(huán)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，放大了的熒光信號(hào)，同時(shí)并不使用PCR對(duì)miRNA進(jìn)行擴(kuò)增。作者采用這種方法能夠在每分鐘內(nèi)處理300到500個(gè)細(xì)胞。對(duì)三種不同的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行分析后，作者確定了miRNA的表達(dá)水平與腫瘤分期的相關(guān)性。最近，有人報(bào)道了使用少量樣本或單細(xì)胞來進(jìn)行捕獲，miRNA擴(kuò)增以及測(cè)序。微流控技術(shù)的進(jìn)一步使用將會(huì)對(duì)數(shù)千個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行全基因組測(cè)序。

蛋白質(zhì)組

除了轉(zhuǎn)錄組外，蛋白質(zhì)組有助于構(gòu)建表型與基因型之間的關(guān)系。蛋白質(zhì)組包括膜結(jié)合型蛋白，細(xì)胞質(zhì)蛋白和分泌蛋白。蛋白的濃度、翻譯后修飾、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移、酶或功能活性以及與其它蛋白質(zhì)或分子的相互作用也會(huì)影響到蛋白質(zhì)表達(dá)譜。蛋白質(zhì)在細(xì)胞分化、DNA復(fù)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝反應(yīng)和分子運(yùn)輸?shù)戎匾募?xì)胞功能方面發(fā)揮著巨大的作用。因此，蛋白質(zhì)組的研究可以推斷生物學(xué)機(jī)制，并能發(fā)現(xiàn)與正常發(fā)育或產(chǎn)生相關(guān)的生物標(biāo)記物、治療靶點(diǎn)和其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)相關(guān)的復(fù)合物。盡管與轉(zhuǎn)錄組相比，蛋白質(zhì)可能具有較少的噪聲，但是要高保真地定量單個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組的挑戰(zhàn)也更大，部分原因是整個(gè)蛋白質(zhì)組的規(guī)模要大于轉(zhuǎn)錄組的數(shù)量級(jí)，并且大多數(shù)信號(hào)蛋白具有低豐度和不穩(wěn)定性。與DNA和RNA相比，蛋白質(zhì)無法直接通過擴(kuò)增來提高信噪比。蛋白質(zhì)組的極度復(fù)雜性和缺乏一致的通過探針為單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析增加了額外的困難。目標(biāo)的技術(shù)在單細(xì)胞水平上檢測(cè)蛋白質(zhì)的通量與靈敏方面仍然存在局限。為了實(shí)現(xiàn)高靈敏度和多路復(fù)用的單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析，微生物平臺(tái)已經(jīng)得到了廣泛的研究和使用。

單細(xì)胞可以被包埋在納米孔中，其分泌的蛋白質(zhì)可以被預(yù)涂有抗體的玻片捕獲，每個(gè)細(xì)胞最多能檢測(cè)4個(gè)蛋白。單細(xì)胞條形碼芯片以能夠在單細(xì)胞水平上對(duì)多個(gè)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。更特別的地方在于，這些芯片含有預(yù)制備的抗體條帶，這些抗體能覆蓋特定的蛋白，可以通過熒光免疫分析的手段來對(duì)蛋白進(jìn)行定量。Ma等人開發(fā)了一種單細(xì)胞條形碼芯片（SCBC，single-cell barcode chip），此芯片能夠檢測(cè)單細(xì)胞分泌的一系列蛋白。利用控制閥門，他們將隨機(jī)加載的單細(xì)胞分散到數(shù)千個(gè)納米孔的微室中。細(xì)胞分泌的蛋白被一個(gè)微室中由DNA編碼的抗體庫所捕獲，該抗體庫是以平行條帶的方式來排列的。蛋白濃度是通過免疫夾心法熒光成像方式來進(jìn)行檢測(cè)的。通過這種平臺(tái)，Ma檢測(cè)了腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分泌的13種效應(yīng)分子。與健康細(xì)胞相比，MART-1（全稱為melanoma-associated antigen recognized by T cells 1，T細(xì)胞識(shí)別黑色素瘤抗原-1）特異性T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因型CTL表現(xiàn)出更高的異質(zhì)性和功能多樣性。

通過優(yōu)化、簡化最初的SCBC的參數(shù)，Lu等人報(bào)道了一種帶有5000個(gè)微槽的芯片設(shè)計(jì)，此裝置能夠分離單個(gè)細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行多種蛋白檢測(cè)(Figure 4 a )。與基于閥門的方法相比，此方法在工作流程和裝置上都減少了復(fù)雜性和體積。細(xì)胞通過管道輸送到的芯片上，并通過策略加載到微槽中。通過位于微槽頂部疊加的高密度的抗體條形碼陣列來檢測(cè)蛋白，從而會(huì)形成一個(gè)熒光免疫夾心。當(dāng)細(xì)胞孵育12小時(shí)后，分離夾心，使用檢測(cè)抗體來捕獲相應(yīng)的細(xì)胞因子，并用微陣列掃描儀進(jìn)行定量。通過結(jié)合不同熒光顏色的光譜編碼和15條空間編碼條帶，該平臺(tái)能夠同時(shí)檢測(cè)42個(gè)效應(yīng)蛋白，這代表了迄今為止單細(xì)胞分泌蛋白分析的最高水平。該裝置與活細(xì)胞工作站和顯微成像系統(tǒng)的兼容也使得分泌蛋白譜與細(xì)胞遷移或相互作用之間的相關(guān)研究成為可能。到目前為止，該平臺(tái)已經(jīng)應(yīng)用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生和細(xì)胞治療中功能異質(zhì)性的研究。

Hao等人報(bào)道了一種連使用連續(xù)微刻的方法來監(jiān)測(cè)單細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的時(shí)間動(dòng)力學(xué)。在這種方法中，單個(gè)細(xì)胞被分布和分離在密集的亞納米孔（84672個(gè)）中，頂部有一張抗體包被的玻片，它能同時(shí)監(jiān)測(cè)三種不同的細(xì)胞因子的釋放。為了檢測(cè)在不同時(shí)間間隔內(nèi)單細(xì)胞蛋白的分泌，在不同的時(shí)間點(diǎn)，要將使用過的抗體包被的玻片換為新制備的玻片。使用這種方法，研究人員檢測(cè)了非粘附T細(xì)胞和粘附巨噬細(xì)胞的動(dòng)態(tài)細(xì)胞因子分泌。Lu等人展示了玻片交換過程中可以加入一個(gè)干擾步驟。作者因此在使用LPS刺激同一巨噬細(xì)胞前后，在同一巨噬細(xì)胞上檢測(cè)了42種不同的分泌蛋白。

除了使用抗體包被的基質(zhì)（如玻片）捕獲目標(biāo)蛋白外，與微球結(jié)合的抗體也是繼液滴或微孔內(nèi)的單細(xì)胞分離之后進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)的重要工具 (Figure 4 b )。Konry開發(fā)了一種使用液滴微流控技術(shù)來包裹T細(xì)胞，捕獲抗體修飾微球的技術(shù)，此技術(shù)通過熒光標(biāo)記的二抗來檢測(cè)蛋白的分泌。雖然這種方法允許在活化的輔助性T細(xì)胞中檢測(cè)IL-10的分泌，但是這種檢測(cè)方法限制了可以同時(shí)檢測(cè)的多個(gè)蛋白，并且操作時(shí)間過長。另外，單細(xì)胞和功能化的抗體微球也可以與熒光標(biāo)記的二抗包埋在微流控和反應(yīng)區(qū)室中。然后根據(jù)微球的熒光強(qiáng)度，可以隨著時(shí)間的推移來監(jiān)測(cè)細(xì)胞分泌的活動(dòng)的動(dòng)態(tài)特征。

除了使用閥門、微孔或液滴這些傳統(tǒng)方法外，納米孔-杠桿技術(shù)最近也成為了檢測(cè)單細(xì)胞分泌體的一種新的解決方案（figure 4c)。這種方案提供了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如實(shí)時(shí)檢測(cè)、單分子級(jí)的靈敏度，以及不依賴于抗體的先驗(yàn)知識(shí)。為了能檢測(cè)分泌蛋白，在微流控裝置內(nèi)的納米孔里，使用光鑷來捕獲單個(gè)細(xì)胞。分泌的細(xì)胞蛋白通過納米孔產(chǎn)生明顯的阻斷電流，電泳的大小與蛋白的體積有關(guān)。Kennedy等人使用這種方法實(shí)時(shí)區(qū)分了三種不同的腫瘤細(xì)胞株，U937、MDA-MB-231和MCF-7，并對(duì)趨化因子CCL5和其它低豐度的生物標(biāo)記物（PI3，TIMP1和MMP1）進(jìn)行了鑒定和動(dòng)態(tài)追蹤。

上述提到的方法是以無損傷的方式檢測(cè)細(xì)胞的分泌蛋白。但是，如果要研究胞內(nèi)蛋白，就必須要在微流控芯片上集成細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)釋放和最終檢測(cè)等功能。一種基于閥門的方法就能解決這種問題，在這種平臺(tái)上，當(dāng)單細(xì)胞通過三態(tài)閥被分離，裂解，加標(biāo)簽后，再利用單分子熒光計(jì)數(shù)手段來對(duì)蛋白進(jìn)行區(qū)分和定量。通過這種靶向方法，不需要的蛋白就通過電泳的方式?jīng)_走，而柱面光學(xué)系統(tǒng)則用于定量感興趣的蛋白。Shi等人報(bào)道了通過引入含有裂解液的額外相鄰腔室的改進(jìn)型SCBC（Figure 4d）。使用這種方法，捕獲的單細(xì)胞就能在芯片上進(jìn)行裂解，隨后分散到裂解液中，翻譯出來的蛋白質(zhì)通過含有11種抗體的條形碼帶進(jìn)行檢測(cè)。通過這種平臺(tái)，他們研究了三種腫瘤膠質(zhì)母細(xì)胞瘤多形細(xì)胞株在不同刺激條件下的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白。為了提高檢測(cè)那些低拷貝數(shù)的胞內(nèi)蛋白質(zhì)靈敏度，使用微孔（60pL）來提高釋放的蛋白濃度，并減少細(xì)胞裂解后蛋白擴(kuò)散的時(shí)間。Yang等人報(bào)道了，使用4種不同大小和3種不同熒光顏色的抗體結(jié)合微珠檢測(cè)了分離出來的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的12種蛋白。

此外，Abseq方法能達(dá)到更高的通量，它每小時(shí)能分析10000個(gè)細(xì)胞的蛋白，并能夠檢測(cè)出更多的膜蛋白（Figure 4e）。在這種技術(shù)里，抗體使用了DNA標(biāo)記，并含有一個(gè)UMI，還含有抗體特異性序列，它們能夠分別識(shí)別PCR的重復(fù)序列，以及感興趣的蛋白。分離了單細(xì)胞后，使用蛋白質(zhì)酶K裂解液來裂解細(xì)胞。然后，通過三個(gè)液滴的融合，將單細(xì)胞裂解產(chǎn)物、單細(xì)胞條形碼和生成的PCR合并成一個(gè)。隨后使用重疊延伸PCR技術(shù)將細(xì)胞特有的條形與抗體條形碼耦合起來。通過增加每個(gè)抗體的DNA標(biāo)記數(shù)，可以進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)靈敏度。到目前為止，這種方法僅限于檢測(cè)表面蛋白。但是，從理論上講，序列標(biāo)簽可以唯一地標(biāo)記針對(duì)細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白或整個(gè)蛋白質(zhì)組的抗體，這就能夠有更大的機(jī)會(huì)找到新發(fā)現(xiàn)。

單細(xì)胞Western blotting(scWestern)是另外一種分析蛋白方法。Hughes等人使用scWestern技術(shù)，一次分析了數(shù)千個(gè)單細(xì)胞中的2到3個(gè)蛋白，但是如果重復(fù)漂白和復(fù)染，則能檢測(cè)多達(dá)11個(gè)靶蛋白(Figure 4 f )。當(dāng)細(xì)胞在開放的微孔陣形中鎖定后，單個(gè)細(xì)胞就在芯片上被裂解。然后使用PAGE凝膠電泳分離細(xì)胞裂解液中的蛋白，隨后使用光引發(fā)印跡（photoinitiated blotting）方法來固定蛋白。最終使用熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行檢測(cè)，并用微陣列掃描儀進(jìn)行定量。Hughes使用這方法不僅可以檢測(cè)蛋白，還能夠區(qū)分異構(gòu)體。該方法還可以應(yīng)用于大刀神經(jīng)干細(xì)胞、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，CTCs以及不同亞細(xì)胞區(qū)室的分析。

最后，細(xì)胞免疫染色是一種直接的檢測(cè)胞內(nèi)蛋白的技術(shù)，它可以很容易地集成到微流控芯片中?？梢允褂盟畡?dòng)力，電活性微孔陣列或數(shù)字微流控裝分離單個(gè)細(xì)胞，并使用免疫化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。染色的細(xì)胞隨后可以通過熒光顯微鏡或微流控流式細(xì)胞術(shù)來進(jìn)行分析。Ng等人已經(jīng)使用此策略來對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、刺激和檢測(cè)。這種裝置能用于檢測(cè)血小板衍生生長因子受體及其下游信號(hào)蛋白Akt的磷酸化狀態(tài)，研究化學(xué)刺激對(duì)血小板衍生生長因子受體磷酸化狀態(tài)的影響。

代謝組學(xué)

單細(xì)胞水平上的代謝物為基因型和表型之間提供了另一種聯(lián)系。代謝物包括所有的細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜和分泌型代謝物，包括脂質(zhì)和碳水化合物。單細(xì)胞代謝譜與其它組數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合時(shí)，通過提供代謝中間產(chǎn)物的更全面的數(shù)據(jù)，有助于識(shí)別基因型-表型的相關(guān)性。最近，代謝組學(xué)已經(jīng)應(yīng)用于藥物開發(fā)和傳遞，毒理學(xué)以及生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。然而，由于代謝物比生物分子（例如DNA和蛋白質(zhì)）小，因此很難于其進(jìn)行表征。從傳統(tǒng)角度來講，多個(gè)單細(xì)胞隔離平臺(tái)，例如使用激光燒蝕電噴霧電離(LAESI)和基質(zhì)輔助激光解吸離子化技術(shù)（Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)來分析代謝物。然而，由于代謝物比生物分子更小，傳統(tǒng)的方法無法在不成比例地稀釋樣本或總體樣本損失的情況下來處理如此小的樣本。這些方法也缺乏檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中存在的微量代謝物所需要的靈敏度。

微流控裝置作為單細(xì)胞高通量代謝研究的有力工具，具有很大的應(yīng)用潛力。盡管微流控裝置已經(jīng)被用于研究代謝物的平臺(tái)，但是很少有研究將其應(yīng)用于單細(xì)胞水平上代謝物。另一個(gè)挑戰(zhàn)則是，大多數(shù)單細(xì)胞裝置只出現(xiàn)在特定代謝物上，限制了它們?cè)谔厥忸I(lǐng)域的應(yīng)用，無法實(shí)現(xiàn)多個(gè)代謝物的分析。此外，由于特定的代謝物研究是基于先驗(yàn)知識(shí)，有關(guān)新發(fā)現(xiàn)的機(jī)遇仍然只限于微型硬件技術(shù)。盡管微流控技術(shù)在提高通量方面有著巨大的潛力，但是它們?cè)诟淖冋５募?xì)胞行為方面還存在著挑戰(zhàn)。這會(huì)產(chǎn)生一些人為因素，這些因素有可能不利于代謝組學(xué)的研究，因?yàn)榇x物在單細(xì)胞水平上的濃度極小。盡管存在著這些挑戰(zhàn)，但是單細(xì)胞代謝組學(xué)的分析系統(tǒng)仍然在進(jìn)步中。

Cheng等人提出一種微電極-微流控系統(tǒng)，此系統(tǒng)可以產(chǎn)生單個(gè)跳動(dòng)的心臟細(xì)胞的代謝譜。在人工模擬心臟跳動(dòng)的微電極場(chǎng)刺激后，電化學(xué)生物傳感器就會(huì)檢測(cè)單細(xì)胞中乳酸的生成。細(xì)胞外pH和細(xì)胞內(nèi)鈣熒光，以及細(xì)胞收縮力，也能通過原位顯微鏡進(jìn)行評(píng)估，這種技術(shù)為心臟細(xì)胞的電位狀態(tài)和代謝狀態(tài)指明了方向。

在一個(gè)高通量的研究中，Boedicker等人使用基于插頭的微流控將單個(gè)細(xì)菌捕獲到納米液滴中。釋放的代謝物可以更容易地通過隨機(jī)約束（stochastic confinement），在這種情況下，代謝物會(huì)保留在細(xì)胞附近。研究者利用利用甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌的代謝譜檢測(cè)了藥物的最低抑菌濃度，并從人血漿標(biāo)本中鑒定出敏感和耐藥的金黃色葡萄球菌菌株。該平臺(tái)有利于對(duì)同一樣本進(jìn)行多種檢測(cè)，說明了其在有效的點(diǎn)對(duì)點(diǎn)診斷和針對(duì)患者的細(xì)菌感染治療方面有著應(yīng)用。

單細(xì)胞代謝物可以通過特定傳感分子來檢測(cè)。Tang等人開發(fā)了一種用于胸腔積液腫瘤細(xì)胞葡萄糖攝取測(cè)量的微孔芯片平臺(tái)(Figure 5a )。當(dāng)細(xì)胞被加載到含有200000個(gè)微孔的設(shè)備上時(shí)，一個(gè)熒光葡萄糖類似物2-NBGD就加進(jìn)去，與細(xì)胞共同孵育，然后用自動(dòng)高速熒光顯微鏡對(duì)微孔芯片進(jìn)行掃描。使用計(jì)算機(jī)算法對(duì)圖片進(jìn)行分析，以確定標(biāo)記出那些高葡萄糖攝取的癌細(xì)胞，以便于進(jìn)行后續(xù)的單細(xì)胞測(cè)序。此外，Molter等人設(shè)計(jì)出了一種玻璃微芯片，該芯片包含一個(gè)氧傳感器，氧傳感器是由鉑磷-聚苯乙烯珠制成的，并沿著微孔底部分布。當(dāng)細(xì)胞浸入培養(yǎng)基中，并接種后，有一個(gè)連接在活塞上的玻璃蓋子就會(huì)關(guān)閉，在微孔上形成一個(gè)封閉膜，隨后就檢測(cè)氧含量。

另外，Xue等人報(bào)告了一種通過SCBC對(duì)單個(gè)細(xì)胞的代謝物和蛋白質(zhì)進(jìn)行多重分析的，集成自動(dòng)化微芯片方法 (Figure 5 b )。他們使用DEAL方法，將代謝物特異性的大分子探針和蛋白捕獲抗體固定在單細(xì)胞微室的條形碼上。單細(xì)胞（每張芯片100個(gè)細(xì)胞）通過裂解液在芯片上裂解，然后用可編程閥門進(jìn)行分割。代謝物是通過競爭性結(jié)合的手段來進(jìn)行分析的，而蛋白質(zhì)則是通過可視化的夾心免疫熒光法來進(jìn)行分析。利用這種平臺(tái)，研究人員使用了表皮生長因子受體抑制劑(EGFR)埃洛替尼(Erlotinib，此藥物能夠降低腫瘤細(xì)胞的葡萄糖消耗)治療24小時(shí)后，研究了每個(gè)患者來源的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤神經(jīng)球腫瘤模型細(xì)胞的代謝物。作為葡萄糖消耗的替代品，有4種代謝產(chǎn)物和7種與代謝相關(guān)蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白被納入檢測(cè)范圍，數(shù)據(jù)都表明了葡萄糖的攝入量總體上是減少的。此外，還能通過多個(gè)代謝產(chǎn)物的摻入來鑒定出兩種不同的代謝表型。

Xue還開發(fā)了一種整合了用于定量單個(gè)細(xì)胞攝取谷氨酰胺的表現(xiàn)競爭分析方法的SCBC芯片。他們分析了16種代謝物、磷酸蛋白和相關(guān)代謝酶。在先前工作的基礎(chǔ)上，他們使用芯片研究了埃洛替尼治療后勢(shì)能與受體酪氨酸激酶信號(hào)之間的關(guān)系。這些單細(xì)胞的研究表明，盡管葡萄糖攝取和磷酸化蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱了，但是癌細(xì)胞的勢(shì)能卻增加了。此外，他們還發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞通量過程和磷蛋白信號(hào)之間的新的相互作用，這就能解釋癌癥患者隊(duì)列中對(duì)EGFR抑制劑的耐藥性。

多組學(xué)

盡管基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)在分析單細(xì)胞方面取得了進(jìn)展，但是單獨(dú)評(píng)估每一類分子還不足以充分了解復(fù)雜的生物系統(tǒng)以及潛在的調(diào)控機(jī)制。通過測(cè)量同一個(gè)單細(xì)胞的多組學(xué)水平，而不是合并從不同細(xì)胞獲得的不同數(shù)據(jù)集，就可以清楚地確定基因型-表型連接。通過這些平行的研究，就可以闡明更復(fù)雜的作用機(jī)制的細(xì)胞異質(zhì)性。例如，對(duì)表觀基因組的研究就可以更好地理解對(duì)細(xì)胞特性、功能和表型的調(diào)節(jié)，而這些則無法單獨(dú)從基因型來預(yù)測(cè)。此外，miRNA與mRNA的共序列分析，則對(duì)miRNA導(dǎo)致的非遺傳性細(xì)胞異質(zhì)性的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和miRNA通過蛋白質(zhì)編碼區(qū)基因調(diào)控提供了新的思路。另外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的研究則提供了表達(dá)動(dòng)力學(xué)的研究思路。隨著這些研究為細(xì)胞異質(zhì)性提供了更加全面的理解，這些技術(shù)在人類健康和疾病方面的應(yīng)用將會(huì)繼續(xù)推進(jìn)。這樣的技術(shù)伴隨著對(duì)醫(yī)學(xué)研究有更深理解力以及促進(jìn)的巨大潛力，微流控設(shè)備現(xiàn)在已經(jīng)日益推動(dòng)著多組學(xué)研究的進(jìn)步。然而，現(xiàn)在想要在同一個(gè)設(shè)備上對(duì)同一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多個(gè)層次組學(xué)的研究還是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。這是由于不同的生物分子檢測(cè)和方案的不兼容性，這些不同的分子具有著不同的靈敏性和特異性要求。

Hao等人報(bào)道了一種集成的微芯片平臺(tái)，該平臺(tái)帶有可控的膜閥，可以同時(shí)對(duì)同一單細(xì)胞進(jìn)行WGA和WTA，從而對(duì)來自同一個(gè)單細(xì)胞的基因和轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行檢測(cè)。這種方法允許在芯片上分離和擴(kuò)增來自于同一個(gè)單細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)mRNA和細(xì)胞核的gDNA。在微室中捕獲單細(xì)胞后，使用高選擇性裂解液連續(xù)裂解細(xì)胞膜和細(xì)胞核，分別收集胞漿和細(xì)胞核內(nèi)容物。然后在該裝置上將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并對(duì)同一細(xì)胞的cDNA和gDNA進(jìn)行全庫擴(kuò)增(Whole pool amplification,WPA)。在進(jìn)行PCR后，進(jìn)行凝膠電泳，測(cè)序，最終就能夠鑒定出來自于同一單細(xì)胞的基因組和轉(zhuǎn)錄信號(hào)。這種技術(shù)進(jìn)步提供了研究干細(xì)胞發(fā)育控制、非基因細(xì)胞間變異性、表觀遺傳調(diào)控和其它基礎(chǔ)生物學(xué)問題的解決方案。

Strijp等人開發(fā)了另外一種方法，這種方法利用壓力驅(qū)動(dòng)的微流控來研究基因組和轉(zhuǎn)錄組。在這種微流控芯片上，使用水捕獲單個(gè)細(xì)胞，然后依次導(dǎo)入細(xì)胞膜和細(xì)胞核裂解液，提取芯片上的單細(xì)胞DNA和RNA。這種兩步驟裂解法避免了專門的清洗步驟，從而減少了樣本的損失。從每個(gè)微孔中收集每個(gè)細(xì)胞的裂解液，然后在芯片上進(jìn)行DNA的WGA。在芯片上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和RNA擴(kuò)增后，就可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。這種技術(shù)和貝葉斯計(jì)算通路模擬的整合已經(jīng)用于從大腸癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中識(shí)別單個(gè)細(xì)胞的腫瘤驅(qū)動(dòng)通路。這些通路后的驅(qū)動(dòng)突變都來源于同一個(gè)單細(xì)胞的DNA。此平臺(tái)有望用于腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的研究，并通過其功能和突變途徑的建立來分析單個(gè)CTCs。Cheow等人通過一種基于閥門的自動(dòng)化高通量微流控平臺(tái)在單細(xì)胞水平上同時(shí)檢測(cè)了DNA甲基化和基因表達(dá)，這種技術(shù)作者稱之為基因型，表達(dá)與甲基化的單細(xì)胞分析（single-cell analysis of genotype, expression, and methylation），作者研究了正在進(jìn)行重編程的原發(fā)性肺腺癌和人類成纖維細(xì)胞。

單細(xì)胞多組學(xué)的另外一個(gè)研究主題就是轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)的相互作用。George & Wang開發(fā)了一種微流控裝置，可以對(duì)同一個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本和分泌蛋白進(jìn)行研究。這種可拆分的單細(xì)胞芯片集成了一個(gè)高度密度的抗體陣列來檢測(cè)膠原包被的納米孔中的分泌蛋白。當(dāng)?shù)鞍妆籈LISA分析后，再通過手動(dòng)操作通過WTA對(duì)單細(xì)胞的mRNA進(jìn)行測(cè)序。作者通過這一工作流程，他們鑒定出了一類與小鼠巨噬細(xì)胞中腫瘤壞死因子α分泌相關(guān)的共表達(dá)基因的細(xì)胞亞型，表明它有可能對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制提供新的思路。Junkin等人使用一種基于閥門的自動(dòng)微流控平臺(tái)，在同一臺(tái)裝置上檢測(cè)了細(xì)胞因子動(dòng)力學(xué)和LPS刺激巨噬細(xì)胞后的mRNA轉(zhuǎn)錄本。在這種裝置里，抗體功能化微球與單個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)，可以檢測(cè)細(xì)胞因子的分子。通過雙抗體夾心法可以檢測(cè)細(xì)胞因子的熒光強(qiáng)度。最終對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行mRNA檢測(cè)。還有人通過一種基于閥門的平臺(tái)，研究了在佛波酯的干預(yù)下，MCF7細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的應(yīng)答情況。

液滴微流控裝置是同時(shí)檢測(cè)RNA表達(dá)和蛋白質(zhì)的另外一種強(qiáng)大的工具。在與DNA條形碼抗體共同孵育后，染色的細(xì)胞就被包裹在含有微珠的納米液滴中，這樣就能捕獲mRNA與寡核苷酸標(biāo)記的抗體。經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和測(cè)序后，從轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組中獲得的信息就能被解析出來。作者使用了這種方法對(duì)人源CD8+淋巴細(xì)胞和臍帶血單個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)性進(jìn)行了研究。最近，一種基于核酸適配體(Aptamer)的技術(shù)被開發(fā)了出來，用于平行研究轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組。這種方法使用核酸適配體探針來標(biāo)記那些含有表位與目標(biāo)蛋白的細(xì)胞，并將其與DNA條形碼微珠和裂解液共同包埋起來。mRNA的polyA序列與核酸適配體就會(huì)使得細(xì)胞裂解后與微珠雜交。當(dāng)進(jìn)行了RT和PCR之后，就匯集所有的液滴，進(jìn)行平行測(cè)序。由于含有共同的細(xì)胞特異性條形碼，這種平臺(tái)就是能串聯(lián)分析細(xì)胞全局?jǐn)?shù)據(jù)（epitome ）與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。這種平臺(tái)能夠基于核酸適配體表面結(jié)合以及基因表達(dá)模式來區(qū)分不同細(xì)胞類型。

如上所述，Xue等人報(bào)道了一種基于閥門的SCBC，此技術(shù)整合了表面競爭結(jié)合分析法與功能蛋白免疫分析法，以及熒光讀數(shù)法，能同時(shí)研究代謝物和蛋白質(zhì)。此外，Zhang等人使用納米孔技術(shù)展示了一種基于微芯片的平臺(tái)，該平臺(tái)能夠使用基于圖像的流式技術(shù)與抗體編碼微陣形技術(shù)來檢測(cè)單個(gè)CTC的葡萄糖攝取和胞內(nèi)功能蛋白。從裂解的細(xì)胞中提取單個(gè)細(xì)胞核，隨后進(jìn)行基因突變的研究。

總結(jié)與未來展望

微芯片技術(shù)的小型化和并行化為單細(xì)胞組學(xué)的研究提提供了前所未有機(jī)遇，這是因?yàn)槲⑿酒夹g(shù)提高了單細(xì)胞組學(xué)的通量、靈敏度和可控性，降低了樣本消耗。正如本文所討論的，這些方法在細(xì)胞發(fā)育和異質(zhì)性方面的新發(fā)現(xiàn)和獨(dú)特發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)研究和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供了最新的工具。

盡管前人做了大量的工作，但是在利用微流控平臺(tái)進(jìn)行單細(xì)胞組學(xué)研究時(shí)，仍然存在著大量懸而未決的問題。未來研究的一個(gè)方向就是進(jìn)一步提高靈敏度、通量和多路復(fù)用，進(jìn)而減少組學(xué)研究中的誤差和偏倚。此外，具有不同模式的微芯片器件的多樣性給質(zhì)量帶來了很大的挑戰(zhàn)，因此制定分析標(biāo)準(zhǔn)與結(jié)果解讀標(biāo)準(zhǔn)對(duì)未來的進(jìn)一步的發(fā)展有著重要意義。

此外，從同一個(gè)細(xì)胞上平行測(cè)量多個(gè)水平的基因組特性仍然不太完善，但是為了更準(zhǔn)確和更全面地了解細(xì)胞類型的狀態(tài)，這還是有必要的。雖然近年來在綜合多組學(xué)方面取得了很大的進(jìn)展，但是這些技術(shù)大多只能同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)組學(xué)層次或三個(gè)組學(xué)層次。理想的平臺(tái)則是能夠提供各個(gè)分子水平上綜合信息。此外，在芯片上集成這些細(xì)胞組學(xué)的數(shù)據(jù)與細(xì)胞表型結(jié)合（例如細(xì)胞的大小與形態(tài)）以及動(dòng)態(tài)特征（例如細(xì)胞生長、增殖、遷移和細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用），能夠最大程度地提供更多的信息輸出。為了從同一個(gè)細(xì)胞中獲取這些聯(lián)系，需要一種精確、簡便的下游分子圖譜檢索方法。如果能夠在單細(xì)胞水平上完全將這些分子特性轉(zhuǎn)換為細(xì)胞行為，則能夠?yàn)檠芯刻峁?qiáng)有力的支撐。這些未來的進(jìn)展可能會(huì)增加單細(xì)胞數(shù)據(jù)的集的復(fù)雜性和廣度，從而?新型的計(jì)算模型來拆分高維數(shù)據(jù)。另外，在單細(xì)胞處理過程中，在保留三維位置空間信號(hào)的同時(shí)，對(duì)多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合的手段還不成熟，從而阻礙了對(duì)復(fù)雜生物組織結(jié)構(gòu)和功能的全面理解。

最后，基于微芯片技術(shù)的商化和臨床轉(zhuǎn)化還有很長的路要走。為了加速這些技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用，必須開發(fā)出功能強(qiáng)大、用戶友好的硬件設(shè)計(jì)。微流控裝置的集成和自動(dòng)化不僅降低了生物學(xué)家和臨床醫(yī)生的使用門檻，并且還能減少人工操作，節(jié)省時(shí)間。這種做法還能降低用戶的實(shí)驗(yàn)偏倚，并提高不同實(shí)驗(yàn)室之間研究的可重復(fù)性，這些都是當(dāng)前人工操作過程中需要注意的問題。成本很有可能是在單細(xì)胞組學(xué)研究中廣泛應(yīng)用微芯片的另外一個(gè)障礙，這個(gè)問題可能通過進(jìn)一步改進(jìn)工作流程來得到解決，例如減少反應(yīng)試劑的用量，提高樣本的處理能力。這些設(shè)備的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模化生產(chǎn)也會(huì)有助于降低成本。

通過基因組學(xué)、表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的多組學(xué)微流控制技術(shù)的流水化集成，就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)細(xì)胞全部異質(zhì)性的達(dá)珍。通過解決通量低，低靈敏底，研究水平低、缺乏足夠和可行的計(jì)算模型以及微流控器件高成本等問題，研究者和從業(yè)人員可以在與健康和疾病相關(guān)的細(xì)胞亞型和物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)中使用這些技術(shù)，從而推動(dòng)單細(xì)胞組學(xué)在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用。