水環(huán)境是環(huán)境構(gòu)成要素之一,也是受人類破壞和影響最嚴(yán)重的領(lǐng)域,水環(huán)境污染已成為當(dāng)今世界主要環(huán)境問題之一,水環(huán)境科學(xué)研究特別是水環(huán)境污染分析備受矚目.水環(huán)境污染分析對象種類廣、含量低,因此分析手段必須具備靈敏、準(zhǔn)確、高速、自動化等特點(diǎn).為了解決所面臨的種種現(xiàn)實(shí)問題,水環(huán)境污染分析動用了現(xiàn)代分析化學(xué)中幾乎所有的檢測技術(shù)和手段,如使用等離子發(fā)射光譜、原子熒光光譜、氣相色譜鄄質(zhì)譜聯(lián)用、高效液相色譜等.在繼續(xù)發(fā)展大型、精密監(jiān)測系統(tǒng)的同時,小型便攜式、自動連續(xù)、簡易快速的監(jiān)測技術(shù)的研究同樣迫在眉睫.例如,在污染物突發(fā)事故或野外連續(xù)觀測的現(xiàn)場,由于水體流動的因素,污染物濃度的變化十分迅速,大型固定儀器的使用受到限制,而便攜式儀器和快速、自動連續(xù)測定技術(shù)就顯得十分重要.在這一領(lǐng)域的研究過程中,微流控芯片技術(shù)起到了極其重要的作用.

一.微流控技術(shù)在水體污染物分析中的應(yīng)用

進(jìn)入水環(huán)境的所有污染物質(zhì)均屬于環(huán)境分析的研究對象.按照其毒性、危害和受關(guān)注程度分為環(huán)境優(yōu)先污染物和其他環(huán)境污染物.微流控芯片技術(shù)在水環(huán)境污染分析中的研究應(yīng)用尚處于起步階段,因此多集中于優(yōu)先污染物的相關(guān)報(bào)道,主要包括重金屬、營養(yǎng)元素、有機(jī)污染物和微生物等.

1.用于水體中重金屬檢測的微流控芯片系統(tǒng)

圖1重金屬檢測微流控芯片系統(tǒng)

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展,越來越多的重金屬如汞、鎘、鉻、鉛、銅、鋅、鎳、鋇、釩等被排放入水體,不僅會對水生動植物產(chǎn)生毒害作用,還能通過富集作用進(jìn)入生物鏈,對整個生態(tài)環(huán)境構(gòu)成嚴(yán)重威脅.對上述重金屬的檢測,雖然可以使用高精度的原子吸收光譜和原子熒光光譜等方法,但是在應(yīng)對突發(fā)性污染物泄露事件,或者對一個區(qū)域進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測的情況下,仍需要快速、高效的檢測工具.Green-wood和Greenway使用光刻法搭配濕法刻蝕技術(shù),成功研制了一種微流控芯片.該芯片利用魯米諾發(fā)光的性質(zhì),成功地對硝酸鈷進(jìn)行了測定,檢測最低限度為3X10-11mol·L-1.該裝置使用造價低廉的光電探測器,在保證了高敏感度的前提下降低了成本,而且將試劑固定在了微芯片之上,實(shí)現(xiàn)了操作的自動化.與此同時,通過簡單的改造之后,該微全分析系統(tǒng)還能成為檢測過氧化氫或者二氧化氮的裝置,并可以與信號傳遞裝置結(jié)合起來,成為一種自帶無線信號發(fā)射功能的設(shè)備.Alves-Segundo等[32]使用發(fā)光二極管和光電二極管,搭配低溫共燒陶瓷,制造了一種基于光度檢測的連續(xù)流動分析微芯片(圖1A).該裝置使用二苯基甲酰胺作為顯色劑對六價鉻進(jìn)行測定,在0.1~20mg·L-1的范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,同時其檢測限最低為50μg·L-1.

基于紙的微流控器件近幾年的發(fā)展也很迅速[33],相對于具有類似功能的微流控設(shè)備[34],它具有操作簡單,不需要外援設(shè)備,可多元檢測等優(yōu)點(diǎn),有望成為最廉價的分析檢測器件.Hossain和Bren-nan[35]利用β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)在重金屬離子的抑制下會失去活性的性質(zhì),配合其他的金屬指示劑,開發(fā)出了一種可以用來檢測多種重金屬的紙芯片(圖1B),顯示了良好的靈敏度.

2.營養(yǎng)鹽測定芯片

用于營養(yǎng)鹽測定的微流控芯片系統(tǒng)多數(shù)是基于分光光度法的檢測原理,運(yùn)用現(xiàn)代微細(xì)加工技術(shù)將各種光電元件加以集成.例如,都柏林城市大學(xué)的McGraw等[36]利用鉬酸銨與磷酸鹽反應(yīng)產(chǎn)生特征黃色或黃綠色這一特點(diǎn),研制了一種用于水體中磷酸鹽監(jiān)測的微流控芯片系統(tǒng).該系統(tǒng)配有數(shù)據(jù)的發(fā)射裝置,可以在目標(biāo)區(qū)域的不同位置分別布置,對該區(qū)域的磷酸鹽污染狀況進(jìn)行全方位的實(shí)時監(jiān)測,檢測限最低為0.3mg·L-1.賈宏新等[37]提出了一種三層雜交結(jié)構(gòu)微流控芯片[玻璃片/聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜/PDMS底片],在玻璃片上加工微反應(yīng)通道,用PDMS加工氣體滲透膜和具有接受通道的PDMS底片,實(shí)現(xiàn)了溶液中NH4+反應(yīng)、生成的氨氣擴(kuò)散分離、吸收、溴百里酚藍(lán)顯色和光度檢測在微流控芯片上的集成化.理論上任何基于流動注射分析技術(shù)-分光光度法的營養(yǎng)鹽測定均可在微流控芯片中實(shí)現(xiàn).但由于微米尺度的微流控芯片通道的吸收光程和光通量均受到很大限制,因此這一類技術(shù)的突破點(diǎn)在于芯片上長光程檢測的實(shí)現(xiàn)。

此外,利用毛細(xì)管電泳的微流控芯片技術(shù)在營養(yǎng)鹽的檢測中也得到了良好的運(yùn)用.Shiddiky等[39]制造了一種基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的微流控芯片,該系統(tǒng)可以在90s內(nèi),同時對亞硝酸鹽離子和硝酸鹽離子完成檢測,最低檢測限分別為(0.09±0.007)μmol·L-1(NO2-)和(0.08±0.009)μmol·L-1(NO3-).Sieben等[40]也做了相似的研究,制造了一種用來檢測亞硝酸鹽的微流控裝置,其檢測限為14nmol·L-1.

3.有機(jī)污染物分析芯片

水體中除含有無機(jī)污染物外,更大量的是有機(jī)污染物,它們以毒性和使水中溶解氧減少的方式對生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響,危害人體健康.因此有機(jī)污染物的數(shù)量是評價水體污染狀況的極為重要的指標(biāo).這一類污染物由于其含量較低,通常需要進(jìn)行前期的預(yù)處理,微流控芯片的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在可以將前期的預(yù)處理以及后期的檢測進(jìn)行集成,并且具有較高的萃取/富集效率.Benhabib等[41]利用基于光譜分析技術(shù)的微流控芯片,對多環(huán)芳烴(polycyclicaromatichydrocarbons,PAHs)進(jìn)行了檢測,其檢測范圍為0.1μg·L-1~400mg·L-1.Nie等[42]制造了一種用介孔材料(CMK-3)修飾的碳盤電極的電化學(xué)檢測芯片,可以檢測水中的硝基苯類化合物(nitroaroma-ticcompounds,NACs).該裝置使用毛細(xì)管電泳裝置來分離4種硝基苯類化合物,在樣本沒有經(jīng)過復(fù)雜預(yù)處理的情況下,其在飲用水中的最低檢測限能達(dá)到3.0~4.7μmol·L-1.Shen等[43]制造了一種微流控芯片,使用毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù),搭配激光誘導(dǎo)熒光檢測法來檢測水體中的溶解有機(jī)碳(dissolvedor-ganiccarbon,DOC).通過對日野川(HinoRiver)和琵琶湖(BiwaLake)的水樣分析得知,在經(jīng)過孔徑為0.45μm的濾膜之后,可以檢測出濃度為1~2mg·L-1的DOC.Ha等[44]利用基于毛細(xì)管電泳鄄安培檢測系統(tǒng)的微流控芯片,對雙酚A為代表的一些內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行了檢測.該系統(tǒng)的主要結(jié)構(gòu)是采用普魯士藍(lán)修飾的氧化銦錫(ITO)電極,并配合彎曲的微通道.經(jīng)過微通道的有效分離之后,該系統(tǒng)對于雙酚A的檢測限為59nmol·L-1.然而該芯片目前只應(yīng)用于檢測被泡沫塑料污染過的水體,這僅僅是對于內(nèi)分泌干擾素檢測的初級階段,對于科研工作者而言,下一步要做的工作是對更廣泛的污染物檢測進(jìn)行深入的研究.

4.微生物檢測芯片

水體中的微生物按其粒徑,屬于顆粒有機(jī)碳(particularorganiccarbon,POC)范圍,其種群豐度可以反映水體生態(tài)特征和一些重要的污染狀況(如大腸桿菌可反映水體受糞便污染的程度、赤潮藻豐度可預(yù)警或指示赤潮,而嗜油菌豐度可顯示水體受溢油危害程度等),是水體生態(tài)調(diào)查中的常規(guī)監(jiān)測指標(biāo).在其測定過程中,流式細(xì)胞術(shù)是最為準(zhǔn)確、快速的方法.但其設(shè)備昂貴、體積龐大、需要專人操作,不適應(yīng)現(xiàn)場、連續(xù)監(jiān)測要求.基于鞘流式流體控制的微流控芯片的出現(xiàn)在一定程度上克服了這些局限,并可能實(shí)現(xiàn)儀器的集成化、小型化、自動化和便攜化.其測定原理與流式細(xì)胞儀相似.首先對細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記(可發(fā)出自體熒光的無需標(biāo)記),采用電動力、壓力或空氣夾流等形成鞘流的方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞進(jìn)樣,細(xì)胞流經(jīng)激光誘導(dǎo)熒光檢測區(qū)后,根據(jù)檢測到的熒光信號的有無和強(qiáng)弱進(jìn)行計(jì)數(shù),并可借助多種控制方式(如電[45]、光鑷[46]和泵閥[47]等)進(jìn)一步完成細(xì)胞分選。

除了上述基于流式細(xì)胞術(shù)原理的微流控芯片以外,免疫分析和分子雜交也是較為常用的技術(shù).Bey-or等[48]開發(fā)出了一種固定了免疫磁珠的微流控芯片,可以從稀釋的樣本中檢測并分離出大腸桿菌O157：H7.通過芯片外的PCR預(yù)處理技術(shù)和芯片中的毛細(xì)電泳技術(shù),可以有效提高捕獲細(xì)胞的效率.該芯片對于微生物的捕捉效率為70%,其檢測限為2cfu·μL-1.與此相似,Dharmasiri等[49]制造出了一種以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)為材質(zhì),并且經(jīng)過多克隆抗體pAb修飾的微流控多通道芯片,可以同時檢測8個不同的樣本,也可以對同一個樣本進(jìn)行8個平行檢測,檢測下限為6~10cfu·mL-1.該芯片的優(yōu)點(diǎn)可以對樣品進(jìn)行預(yù)濃縮和富集,避免了潛在污染物對目標(biāo)分析的干擾.Metfies等[50]利用分子雜交技術(shù),開發(fā)出一種使用rRNA作為探針的微流控芯片.該芯片擁有兩段18SrRNA作為探針,可以形成兩個特異性檢測區(qū)域,在將微生物破碎,提取總DNA并進(jìn)行PCR以后,成功地對亞歷山大藻(Alex-andriumostenfeldii)進(jìn)行了檢測.

二、基于微流控芯片的水污染生物監(jiān)測系統(tǒng)

水環(huán)境污染分析除了要闡明水體污染物質(zhì)的組成、狀態(tài)和含量以外,還要分析水體污染狀況并對水環(huán)境的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)做出評價.在此過程中,為了補(bǔ)充物理、化學(xué)分析方法的不足,主要采用生物監(jiān)測法.在水污染的生物監(jiān)測法中指示生物可采用水生微生物、植物和動物等.由于芯片尺寸微小,通道是微米級別的,與細(xì)菌、微藻類相匹配.因此,該類生物被較多應(yīng)用在基于微流控芯片的水污染生物監(jiān)測系統(tǒng)中.這里按照所測定指標(biāo)的不同,分別進(jìn)行總結(jié).

1.微藻生長分析芯片系統(tǒng)

水污染引起水體各種物理、化學(xué)條件的改變,這些改變直接影響到生活在水中的藻類的生長、繁殖.因此,藻類生長抑制(algaegrowthinhibition)是生物法監(jiān)測地表水和地下水水質(zhì)的基本參數(shù).作者所在課題組設(shè)計(jì)并制作了一種集成污染物濃度梯度生成器和擴(kuò)散式藻類培養(yǎng)單元的微流控芯片(圖2)[51].該芯片以PDMS為基本材質(zhì),中間夾雜聚碳酸酯膜,可在線完成污染物梯度添加、微藻培養(yǎng)、受激和檢測過程,極大地簡化了藻類毒性試驗(yàn)操作過程.試驗(yàn)選取5種常見微藻,包括3種綠藻、1種硅藻和1種紅藻,進(jìn)行微流控芯片培養(yǎng).結(jié)果表明,微流控芯片微藻培養(yǎng)顯示了與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)微藻培養(yǎng)類似的種群增殖曲線,從而首次證明了以PDMS材質(zhì)微流控芯片作為微藻實(shí)驗(yàn)平臺的可行性.同時,以青島大扁藻(Platymonashelgolandicavar.tsingtaoensis)、亞心扁藻(Platymonassubcordiformis)、小球藻(Chlorella)和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)為受試對象,研究其在重金屬脅迫下的表觀增殖率的變化情況,顯示了良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系.

圖2海洋微藻培養(yǎng)及毒性篩選微流控芯片示意圖及實(shí)物圖

2.微生物自體熒光檢測芯片

很多微生物具有內(nèi)源熒光物質(zhì),可通過靈敏的激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)來進(jìn)行研究,從而獲得關(guān)于新陳代謝狀態(tài)的信息以及其他各種微生物中存在的信息.如葉綠素?zé)晒饧夹g(shù),就是以細(xì)胞內(nèi)葉綠素作為天然探針,以光合作用理論為基礎(chǔ),研究和探測生物光合生理狀況及各種外界因子對其細(xì)微影響的新型活體測定和診斷技術(shù),具有快速、靈敏、易行、對細(xì)胞無損傷等優(yōu)點(diǎn).

Podola等[52]研制了一種非選擇性膜固定式微藻傳感器芯片系統(tǒng)(圖3A),該芯片以玻璃纖維板作為基底層,用來提供培養(yǎng)基和污染物,上面封接上雙層賽璐珞膜,雙層膜之間夾有12個圓微藻固定區(qū)域,并以常規(guī)IMAGING-PAM葉綠素?zé)晒鈨x做為檢測器.該芯片系統(tǒng)的優(yōu)勢在于可在12個區(qū)域固定不同微藻,利用其對于不同污染物敏感程度的差異,對污染物種類做出初步判斷.其不足在于檢測系統(tǒng)仍外圍化,集成度不高.

圖3微藻葉綠素?zé)晒鈾z測芯片

Lefvre等[53]在這方面工作中取得了較大的研究進(jìn)展,制造了一種基于PDMS材質(zhì),集成了有機(jī)發(fā)光二極管(OLED)和有機(jī)光電探測器(OPD)的微流控芯片(圖3B).以萊茵衣藻(Chlamydomonasrein-hardtii)為指示對象,檢測水體中除草劑敵草隆,其檢測限能低至11nmol·L-1.盡管該微流控芯片能在很低的濃度下對污染物進(jìn)行監(jiān)測,然而它在很多方面依然有改進(jìn)和提升的空間:1)減少基片厚度,并集成顯微鏡頭陣列,可以有效改善OLED和OPD之間的聯(lián)系,并提高接受信號的質(zhì)量;2)縮短OLED發(fā)射的波長,使其對海藻的刺激作用更有效率;3)采用對污染物敏感度更高的海藻,進(jìn)一步降低檢測限.

此外,Garca-Alonso等[54]開發(fā)出一種基于酵母熒光的微流控芯片.該芯片是利用釀酒酵母(Sac-charomycescerevisiae)暴露在基因毒素的條件下能表達(dá)出綠色熒光蛋白的性質(zhì),對甲基-甲磺酸鹽進(jìn)行了有效的檢測.試驗(yàn)結(jié)果表明,每單位面積的熒光強(qiáng)度與甲基-甲磺酸鹽暴露的時間呈正相關(guān).

3.微生物活性的熒光分析芯片

微生物的細(xì)胞活性可以直接從細(xì)胞層面反映水污染狀況,可利用外源熒光探針分析法進(jìn)行測定.在這方面研究工作中,流式細(xì)胞術(shù)的出現(xiàn)起到了重要的推動作用,眾多研究者以細(xì)菌和微藻為受試生物,結(jié)合多種熒光探針評價了重金屬、農(nóng)藥和有機(jī)污染物的生物毒性。

由于流式細(xì)胞儀設(shè)備昂貴、體積龐大,難以適應(yīng)現(xiàn)場要求.因此,作者所在課題組在微生物活性熒光分析芯片的研制方面做了積極的探索,設(shè)計(jì)并制作了一種基于PDMS材質(zhì)的微流控芯片[51],尺寸為63mmX63mm,以熒光素二乙酸酯(fluoresceindiac-etate,FDA)為探針,測定重金屬Cu脅迫下小球藻(Chlorella)和紫球藻(Porphyridiumcruentum)的酯酶活性,呈現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系.目前,該芯片系統(tǒng)仍采用外源檢測設(shè)備,包括熒光倒置顯微鏡和CCD成像系統(tǒng),因此,只適用于實(shí)驗(yàn)室研究.下一步工作的方向是檢測設(shè)備,包括OLED和OPD的微流控芯片的集成,開發(fā)適于現(xiàn)場檢測的小型化儀器.

在儀器集成化方面,Fukuba等[57]取得一定的研究進(jìn)展.他們利用海洋中微生物活性與其所在環(huán)境中的ATP含量(包括溶解與未溶解的)密切相關(guān)的原理,使用熒光素-熒光素酶(luciferin-luciferase)體系,定量分析了海水中ATP的含量,以及在ATP數(shù)量下降時周圍環(huán)境中微生物的消退狀況.通過使用集成式原位ATP裝置“IISA(integratedinsituana-lyzer)-ATP冶(圖4A、B)進(jìn)行分析,在2X10-12~2X10-8mol·L-1的范圍內(nèi),ATP的檢測限為1.1X10-11mol·L-1,通過在日本東京灣和沖繩島的原位測試顯示,ATP的含量分別為2.7X10-10和3.4X10-10mol·L-1.

圖4集成式原位ATP裝置

近些年來,隨著各種分析和監(jiān)測手段的發(fā)展,微流控芯片技術(shù)取得了巨大的進(jìn)步.考慮到了解人類活動對生態(tài)環(huán)境影響程度的需求日益增加,越來越多的科研組織已經(jīng)認(rèn)識到微流控裝置在環(huán)境監(jiān)測和生態(tài)分析中的優(yōu)勢,并投入力量進(jìn)行研發(fā).

由于其低廉的造價以及易于操作等優(yōu)點(diǎn),微流控設(shè)備擁有巨大的成為便攜式裝置的潛力.我們認(rèn)為,未來微流控分析裝置的發(fā)展,將著眼于兩個方面:一是生產(chǎn)功能高度集成的微流控芯片系統(tǒng)或簡單易用的紙芯片,這樣可以使更多沒有經(jīng)過專門培訓(xùn)的人員對微流控裝置進(jìn)行操作;二是與傳統(tǒng)的分析設(shè)備相比,便攜化依然是微流控芯片的最大優(yōu)點(diǎn).但是目前受技術(shù)限制,微流控設(shè)備在檢測精度及抵抗外界因素干擾等問題上,與傳統(tǒng)設(shè)備仍有一定的差距,這在某種程度上限制了微流控設(shè)備的使用.然后在應(yīng)對諸如突發(fā)生態(tài)污染事故、或者需要大面積估計(jì)一個區(qū)域某項(xiàng)生化指標(biāo)等情況下,微流控芯片仍具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢.科研人員現(xiàn)在正在努力在保持便攜性的基礎(chǔ)上,使微流控裝置提高測量精度,并具有處理更加復(fù)雜樣品的能力.

從目前的發(fā)展水平來看,微流控芯片已經(jīng)突破了其發(fā)展初期在加工技術(shù)和基本流控技術(shù)上的主要難關(guān),正在進(jìn)入一個更深入的基礎(chǔ)研究、廣泛擴(kuò)大應(yīng)用領(lǐng)域及深度產(chǎn)業(yè)化的轉(zhuǎn)折時期.在相關(guān)技術(shù)方面,比如材料表面改性、流體驅(qū)動與控制、試樣反應(yīng)與混合、接口技術(shù)、系統(tǒng)集成等方面,也取得了卓有成效的進(jìn)展.從生態(tài)環(huán)境分析與檢測的角度來看,現(xiàn)有技術(shù)水平的微流控芯片不僅可以監(jiān)測并分析水環(huán)境中諸多不同類別的污染物,比如重金屬、營養(yǎng)鹽、有機(jī)污染物,以及有害微生物等,還可以對微藻數(shù)量、ATP含量等進(jìn)行定量的分析.上述指標(biāo)都可以從不同角度反映出水環(huán)境的生態(tài)狀況,為進(jìn)一步的研究提供第一手的數(shù)據(jù).因此,可以預(yù)計(jì)的是,微流控芯片將在不遠(yuǎn)的將來取代當(dāng)前分析實(shí)驗(yàn)室中的很多設(shè)備,并進(jìn)入生產(chǎn)現(xiàn)場、監(jiān)測區(qū)域等成為主流的污染監(jiān)測和生態(tài)分析工具,使便攜式“個人實(shí)驗(yàn)室冶成為現(xiàn)實(shí).

文章來源：應(yīng) 用 生 態(tài) 學(xué) 報(bào) 2014 年 4 月 第 25 卷 第 4 期 《微流控芯片在水環(huán)境污染分析中的應(yīng)用》作者：王 虎 魏俊峰 鄭國俠

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