近年來(lái),人們?cè)?/span>紙質(zhì)芯片的制作和應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn)，紙質(zhì)芯片由于機(jī)械強(qiáng)度低,在操作過(guò)程中容易造成對(duì)基質(zhì)材料本身和芯片圖形的損壞,使得其應(yīng)用受到了限制。因此,尋找新的基質(zhì)材料并制作出具有較高應(yīng)用價(jià)值的薄膜芯片尤為必要.本文對(duì)一系列薄膜基質(zhì)材料進(jìn)行了篩選,并對(duì)制作工藝進(jìn)行了改進(jìn),制作了一種基于尼龍微孔薄膜的芯片。進(jìn)一步將葡萄糖氧化酶和辣根過(guò)氧化物酶固定在該薄膜芯片上,利用酶促化學(xué)反應(yīng)對(duì)葡萄糖樣品進(jìn)行了研究,并通過(guò)顏色變化對(duì)不同濃度的葡萄糖進(jìn)行顯色分析。研究結(jié)果表明,這種新型尼龍微孔薄膜芯片具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1實(shí)驗(yàn)部分

1試劑與儀器

乙醇和氫氧化鈉(分析純);碘化鉀(分析純)、葡萄糖(分析純)、葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase,GOD)和辣根過(guò)氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)。

聚醚砜樹(shù)脂濾膜(PES,孔徑0-22滋m)、聚偏氟乙烯濾膜(PVDF,孔徑0-22滋m)、聚四氟乙烯濾膜(PTFE,孔徑0-45滋m)、醋酸纖維素濾膜(CA,孔徑0-22滋m)、混合纖維樹(shù)脂濾膜(水膜,孔徑0-22滋m)和尼龍濾膜(Nylon,聚己二酸己二胺,孔徑0-45滋m)的厚度均為100滋m。SC-B型勻膠臺(tái)；GP18正型紫外光刻膠；URE-2000/35型深紫外光刻機(jī);CT-946型電熱板；PDC-MG等離子體清洗器。

2實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.1尼龍薄膜微孔微流控芯片的制作

芯片的制作過(guò)程如圖1所示.首先將厚度為100滋m左右的尼龍微孔薄膜浸潤(rùn)到紫外光刻膠中2~3min,待微孔薄膜被光膠充分浸潤(rùn)后,取出薄膜并滴瀝多余的光膠,常溫下放置5~10min,使光膠初步固化,再將此薄膜放置在電熱板上于80益烘烤15min,以形成堅(jiān)硬的薄膜光膠層。采用高分辨激光打印在黑白膠片上制作用于設(shè)定的通道形狀的掩膜。將掩膜覆蓋在光膠層上進(jìn)行紫外光刻,10min后光刻結(jié)束,將曝光過(guò)的紫外光膠用7-0g/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行清洗,形成目標(biāo)通道圖形。然后將薄膜芯片用去離子水清洗,使其處于中性的pH值環(huán)境.再將此薄膜芯片置于電熱板上于80益烘干10min,制得干燥的薄膜芯片,然后用等離子體處理1min,以增強(qiáng)其親水性,即制得所需的尼龍微孔薄膜微流控芯片.

2.2葡萄糖的檢測(cè)

將葡萄糖氧化酶和辣根過(guò)氧化物酶的混合溶液(濃度均為30U/mL)滴加在薄膜微芯片的圓形反應(yīng)檢測(cè)區(qū)域(圖1中的3個(gè)外圍圓形區(qū)域),待其干燥后在相同的位置滴加相同體積的0-6mol/L碘化鉀溶液,在空氣中自然揮干后待用.

Fig.1Fabricationprocessofmembrane-basedmicrofluidicchip

將不同濃度的葡萄糖樣品溶液滴加在芯片的進(jìn)樣位置(圖1中的中心圓形區(qū)域),該溶液通過(guò)沿通道的自由擴(kuò)散可到達(dá)芯片的反應(yīng)檢測(cè)區(qū)域.。10min后反應(yīng)結(jié)束,通過(guò)反應(yīng)產(chǎn)物顏色的響應(yīng)變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)不同濃度的葡萄糖的檢測(cè)分析。將反應(yīng)顯色完全的的芯片拍照后,采用Photoshop圖形軟件將所獲電子圖片轉(zhuǎn)化為8位(bit)的灰度圖片,在灰度圖片上選取反應(yīng)顯色區(qū)域,利用Photoshop軟件讀取這一區(qū)域所有像素點(diǎn)的灰度強(qiáng)度平均值,然后減去空白區(qū)域像素點(diǎn)的灰度強(qiáng)度,即得真實(shí)顏色的強(qiáng)度改變值。基于此,根據(jù)葡萄糖濃度對(duì)顏色強(qiáng)度值進(jìn)行線性擬合即可實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖樣品的定量檢測(cè)[23].

2結(jié)果與討論

1薄膜芯片的制作

1.1薄膜材料的選擇

選取了一系列薄膜基質(zhì)材料用于薄膜微流控芯片的制作。由于正性紫外光膠具有一定的溶解能力,所以要求所選的薄膜材料能夠在光刻膠中穩(wěn)定存在。通過(guò)對(duì)混合纖維素酯膜、聚四氟乙烯膜和尼龍膜等多種薄膜研究比較后發(fā)現(xiàn),紫外光刻正膠能很好地浸潤(rùn)混合纖維素酯膜,但長(zhǎng)時(shí)間的浸潤(rùn)會(huì)導(dǎo)致該薄膜變形、溶解,因此不適于芯片的制作。聚四氟乙烯膜因具有較好的機(jī)械強(qiáng)度而被認(rèn)為是一種理想的芯片制作材料,但研究發(fā)現(xiàn)由于紫外光刻正膠具有一定的親水性,而聚四氟乙烯膜卻具有極強(qiáng)的疏水性,因此導(dǎo)致光刻正膠無(wú)法在四氟乙烯膜表面均勻分布并形成厚度均一的薄膜層,故聚四氟乙烯膜也無(wú)法用于薄膜芯片的制作。相比之下,尼龍薄膜的親疏水性質(zhì)與光刻正膠具有良好的兼容性,可以在其表面形成厚度均一的光膠薄膜,且內(nèi)部微孔也能得到充分的浸潤(rùn).此外,尼龍薄膜由于自身的材料屬性而能在光刻膠中穩(wěn)定存在,因此它是一種理想的制作薄膜芯片的基質(zhì)材料。

1.2芯片通道寬度的選擇

由于薄膜芯片具有微孔的性質(zhì),液體在通道中的流動(dòng)可以不依靠附加的驅(qū)動(dòng)裝置而通過(guò)毛細(xì)擴(kuò)散來(lái)完成,所以液體在不同寬度的通道中會(huì)具有不同的浸潤(rùn)速度,而且不同寬度的光膠隔離帶對(duì)液體的阻擋作用也不同。我們?cè)谥睆綖?/span>50mm的尼龍微孔濾膜上加工了一系列具有不同寬度的微通道和光膠隔離帶(見(jiàn)圖2),考察了液體在不同寬度的微通道中的浸潤(rùn)能力和光膠隔離帶對(duì)液體的阻擋作用.結(jié)果表明,微通道越窄,液體在通道中的浸潤(rùn)速度越慢且浸潤(rùn)距離越短,反之則浸潤(rùn)速度越快且浸潤(rùn)距離越長(zhǎng)。當(dāng)微通道采用等離子體處理后,雖然其親水性得到增強(qiáng),但仍然存在著相同的浸潤(rùn)趨勢(shì)。

Fig.2Fabricatedmicrochannels(unitinmicrometers)(A)andbarriers(B)withvariedwidths(unitinmicrometers)

實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),當(dāng)微通道寬度大于400滋m時(shí),液體就可以保持穩(wěn)定的速度浸潤(rùn)整個(gè)通道;另外,形成的光膠隔離帶越窄,對(duì)液體的阻擋作用越弱.因此,為引導(dǎo)液體能夠按照既定的流路流動(dòng),光膠隔離帶必須具有足夠的寬度以實(shí)現(xiàn)對(duì)液體的阻擋,并防止液體擴(kuò)散的發(fā)生。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)光膠隔離帶寬度達(dá)到240滋m時(shí)即可起到有效的阻擋作用;當(dāng)其小于240滋m時(shí),隨著光膠隔離帶寬度的減小,液體滲過(guò)光膠隔離帶的速度變得更快。對(duì)光膠隔離帶和微通道的進(jìn)一步優(yōu)化后發(fā)現(xiàn),所制作的尼龍薄膜芯片不僅通道規(guī)則、邊緣光滑,還具有較高的分辨率,并可對(duì)流體實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確控制.

2.1.3其它影響因素的考察

在尼龍薄膜芯片的制作過(guò)程中發(fā)現(xiàn),所形成的光膠層的厚度對(duì)流體在芯片通道中的浸潤(rùn)性具有顯著影響.這是由于紫外光刻產(chǎn)生的芯片通道的深度有一定的限制,因此當(dāng)光膠層較厚時(shí),紫外光將無(wú)法完全穿透整個(gè)光膠層,所刻蝕的通道會(huì)因光膠的殘存而對(duì)液體的浸潤(rùn)具有明顯的阻礙作用;而當(dāng)光膠層較薄時(shí),目標(biāo)通道周圍由于缺乏對(duì)光膠的有效阻攔,導(dǎo)致在芯片中流動(dòng)的液體滲透到通道以外的其它區(qū)域.可見(jiàn),控制薄膜光膠層的厚度對(duì)流體在通道中的浸潤(rùn)具有關(guān)鍵的作用。在芯片的實(shí)際制作過(guò)程中,將尼龍薄膜用光膠充分浸潤(rùn)后置于勻膠臺(tái)上,通過(guò)調(diào)節(jié)勻膠的轉(zhuǎn)速來(lái)控制光膠的厚度,轉(zhuǎn)速越高、轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng),所得到的薄膜光膠層厚度越薄,反之則越厚。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,選擇轉(zhuǎn)速為300r/min,轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)間為20s時(shí),可在尼龍薄膜上獲得厚度為150滋m的最適光膠層。

由于該尼龍薄膜芯片將主要用于對(duì)取自生物和環(huán)境等領(lǐng)域樣品的檢測(cè),而所涉及的樣品大多具有親水性,因此增強(qiáng)芯片通道的親水性尤為必要.在得到干燥、規(guī)則的尼龍薄膜芯片后,進(jìn)一步對(duì)尼龍薄膜芯片通道采用等離子體處理2min,使液體在芯片通道中的浸潤(rùn)性和浸潤(rùn)速度明顯增強(qiáng).

2.2葡萄糖的檢測(cè)

如圖3(A)所示,在外圍3個(gè)圓形區(qū)域中分別滴加1滋L葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的混合溶液(體積比5頤1,酶濃度均為30U/mL),待其在常溫下自然揮干后,繼續(xù)滴加1滋L0郾6mol/L的碘化鉀溶液,再在常溫下自然揮干.然后,在中心圓形區(qū)域中滴加待測(cè)葡萄糖樣品溶液1滋L,待反應(yīng)10min結(jié)束后,即可對(duì)其進(jìn)行顯色響應(yīng)分析

檢測(cè)機(jī)理:含有葡萄糖的樣品溶液通過(guò)尼龍薄膜微孔的毛細(xì)擴(kuò)散作用到達(dá)檢測(cè)區(qū)域;葡萄糖在GOD的酶促催化作用下生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫[反應(yīng)式(1)],所產(chǎn)生的過(guò)氧化氫在HRP的催化下會(huì)進(jìn)一步與碘化鉀反應(yīng)生成水和碘單質(zhì)[反應(yīng)式(2)];通過(guò)對(duì)碘單質(zhì)顏色深淺的觀察即可判斷樣品中葡萄糖的含量。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),此尼龍薄膜芯片上外圍圓形檢測(cè)區(qū)域面積的大小對(duì)樣品中葡萄糖的檢測(cè)靈敏度影響明顯。外圍圓形區(qū)域面積越大,所生成的碘單質(zhì)越分散,顏色越淺;反之,所生成的碘單質(zhì)則越集中,顏色越深,檢測(cè)靈敏度越高.因此,在綜合考慮浸潤(rùn)速度和反應(yīng)區(qū)域的面積對(duì)葡萄糖檢測(cè)靈敏度的影響后,最終選擇尼龍薄膜芯片的通道寬度為1mm,外圍圓形反應(yīng)區(qū)域的直徑為3郾5mm.

Fig.3Schematicpatternsofmicrochannelsusedforglucoseassays(A),blankexperiment(B)andthechangedcolorofiodinewith10郾0mmol/L(C),25郾0mmol/L(D),50郾0mmol/L(E)ofglucose

對(duì)一系列不同濃度的葡糖糖樣品溶液進(jìn)行了顯色響應(yīng)研究,發(fā)現(xiàn)碘單質(zhì)顏色的深淺對(duì)樣品中的葡萄糖濃度的高低具有明顯響應(yīng).樣品中葡萄糖的濃度越高,所生成的碘單質(zhì)顏色越深[圖3(E)];而濃度越低則顏色越淺[圖3(C)];與空白實(shí)驗(yàn)[圖3(B)]相比,最淺顏色所對(duì)應(yīng)的葡糖糖的濃度為10-0mmol/L.

研究發(fā)現(xiàn),葡萄糖樣品溶液的滴加速度也會(huì)對(duì)顯色響應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)生較大的影響.滴加速度過(guò)慢會(huì)導(dǎo)致待測(cè)溶液難于到達(dá)檢測(cè)區(qū)域,因此會(huì)延長(zhǎng)顯色響應(yīng)反應(yīng)的時(shí)間;而滴加速度過(guò)快則易導(dǎo)致試樣溢出通道區(qū)域。實(shí)驗(yàn)選擇的葡萄糖樣品溶液的滴加速度為2滋L/min,既可達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)效果,又可使顯色響應(yīng)反應(yīng)在10min內(nèi)完成。

為驗(yàn)證方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性,在不同的尼龍薄膜芯片上進(jìn)行了平行實(shí)驗(yàn).在圖3(A)所示的芯片上,對(duì)特定濃度的葡萄糖進(jìn)行分析檢測(cè),1次操作就可獲得3個(gè)平行檢測(cè)結(jié)果;而進(jìn)一步進(jìn)行3次平行檢測(cè)操作,就能獲得9個(gè)平行檢測(cè)的結(jié)果.然后對(duì)這9個(gè)結(jié)果所產(chǎn)生的顏色強(qiáng)度進(jìn)行灰度值分析,用獲得的相應(yīng)數(shù)據(jù)來(lái)考察此檢測(cè)方法的重復(fù)性.對(duì)濃度為25-0mmol/L的葡萄糖溶液進(jìn)行了3次平行分析,9個(gè)測(cè)定結(jié)果的平均偏差為2-0%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為3郾0%.以上結(jié)果表明,該方法穩(wěn)定可靠,可對(duì)樣品中的葡萄糖濃度水平進(jìn)行準(zhǔn)確有效的顏色響應(yīng).

顯色區(qū)域的圖片經(jīng)過(guò)處理后可得到其灰度強(qiáng)度值,對(duì)灰度強(qiáng)度值與葡萄糖濃度之間的關(guān)系進(jìn)行了研究.結(jié)果表明,灰度強(qiáng)度值隨著葡萄糖濃度的增大而上升,但濃度越大,強(qiáng)度變化幅度越小并趨于平緩[圖4(A)].值得一提的是,雖然檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的顏色深淺與碘單質(zhì)的分散程度有關(guān),但采用Photoshop軟件讀取像素灰度平均值時(shí),是對(duì)整個(gè)圓形反應(yīng)區(qū)域進(jìn)行讀取,然后求其平均值,因此不太均一分布的碘單質(zhì)顏色不會(huì)對(duì)最終的計(jì)算結(jié)果造成影響.在0~30郾0mmol/L范圍內(nèi)對(duì)碘單質(zhì)的顏色灰度強(qiáng)度鄄葡萄糖濃度之間的關(guān)系進(jìn)行了線性擬合,其線性方程為

式中,y為碘單質(zhì)的顏色灰度強(qiáng)度值,x為葡萄糖溶液的濃度(mmol/L).該方法對(duì)葡萄糖的最低檢測(cè)濃度為5mmol/L.將此法用于健康人尿液中葡萄糖的含量檢測(cè),結(jié)果如圖4(B)所示.當(dāng)在健康人的尿液中添加濃度為10郾0mmol/L的葡萄糖溶液時(shí),以碘單質(zhì)的顏色灰度強(qiáng)度所測(cè)得的實(shí)際葡萄糖的濃度為(10郾0依0郾4)mmol/L.結(jié)果表明,該方法可滿足定量分析實(shí)際樣品中葡萄糖的要求.

Fig.4Plotofmeanintensityasafunctionofglucoseconcentration(A)andthechangedcolorofiodinefromurineassay(B)

3結(jié)論

以尼龍微孔薄膜為基質(zhì)材料,采用光刻法制作了一種新型薄膜微流控芯片。通過(guò)對(duì)制作工藝進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn),使薄膜芯片的制作步驟及周期大為簡(jiǎn)化和縮短。在該芯片上固定葡萄糖氧化酶和辣根過(guò)氧化物酶后,利用二步酶促化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同濃度葡萄糖的顯色響應(yīng)。結(jié)果表明,所制作的尼龍薄膜微流控芯片具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性,可用于實(shí)際生物樣品中葡萄糖的檢測(cè)。 

文獻(xiàn)來(lái)源高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)doi:10.7503/cjcu20120349作者：楊俊，齊莉，馬會(huì)民，陳義（轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）