2001年2月12日，中、美、日、德、法、英等國科學家和美國賽萊拉公司公布了人類基因組圖譜和初步分析結果。這是人類對自身奧秘的探索史上一個重要的里程碑。研究結果顯示，人類 99.99%的基因是相同的，僅萬分之一的不同基因造就了個體間豐富的差異。了解這種差異對于基礎生物學和醫(yī)學等方面研究都具有巨大的應用價值。

在基因研究中，聚合酶鏈式反應( Polymerase chain reaction，PCR)是一種常用手段。PCR技術最先由 Mullis 等在1985 年發(fā)明，并獲得了1993 年的諾貝爾化學獎。PCR的過程包括 3 個步驟: 變性、退火、延伸，需要在高低中 3 個不同的溫度( 高溫變性: 90℃～95℃，低溫退火: 55℃～60℃; 中溫延伸: 70℃～72℃) 下進行。除了反應區(qū)域溫度的調節(jié)，實驗中還涉及到反應物、酶、DNA 模板溶液體積的精準測量，反應體系的混合，溶液的驅動和控制等。傳統(tǒng)的PCR儀器中的反應是通過樣品槽–反應管–樣品之間的熱傳遞實現(xiàn)的，存在反應時間長、反應體積大、能量消耗多、易產生副產物、不便于集成與攜帶等缺陷。

微流控( Microfluidics) 是一門在μm～mm尺度下研究流體的處理與操控的技術，集成化的微流控芯片還可以將采樣、稀釋、反應、分離、檢測、分析等多個步驟融為一體，已廣泛用于化學、生物等各領域。利用微流控芯片，傳統(tǒng) PCR儀存在的各種問題都有了解決的可能。例如:微小的反應體系可以使熱傳遞更迅速，顯著提高擴增速度，同時避免非特異性擴增，提高反應效率;全封閉的體系可以減少頻繁的手工操作引入的樣本污染和溶液損失;系統(tǒng)微型便攜，利于現(xiàn)場實時檢測等。

一、微流控 PCR芯片

用于制作微流控芯片的材料有硅、玻璃、石英、金屬和有機聚合物如環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)、聚碳酸酯(PC)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)等。其中,硅和玻璃具有良好的化學惰性和熱穩(wěn)定性,與硅相比,玻璃的機械強度更高,是制作PCR芯片的主要材料。 PDMS生物相容性好,可塑性強, 并且PDMS表面與很多材料表面都有很好的親和力,易于實現(xiàn)可逆封裝,可以用于制作生化分析器 件。 但是PDMS的導熱系數(shù)小,散熱性差等特性在某些情況下不利于 PCR 反應的進行,可以與熱傳導性能好的玻璃形成混合芯片結構,同時改善PCR芯片的散熱和光學性能。

根據芯片的結構差異可將PCR芯片分為靜止 PCR與動態(tài) PCR，或微池型PCR( Microchamber PCR，MC-PCR) 與連續(xù)流動 PCR( Continuous-Flow PCR，CF-PCR) 。

微池型 PCR的特點在于，反應體系不流動，通過芯片整體升溫降溫的循環(huán)來實現(xiàn)反應; 連續(xù)流動PCR則由反應液體循環(huán)流過不同溫區(qū)進行擴增。在連續(xù)流動型 PCR芯片中，反應溶液沿著微通道在3個固定的溫度區(qū)連續(xù)流動，3個溫度分別對應高溫變性區(qū)、低溫退火區(qū)和中溫延伸區(qū)，在每個溫區(qū)的流動時間和速度決定了反應時間。每流過3 個溫區(qū)為一次循環(huán)， PCR溶液按照所需的循環(huán)數(shù)依次流動，最后完成整個擴增反應。

1.微池型 PCR芯片

微池型 PCR芯片是傳統(tǒng) PCR的微型化，有單反應池，液滴虛擬微池及微池陣列3 種設計。單反應池結構簡單，1993 年由 Northrup 等首次報道，他們在硅基質上刻蝕出空腔，加入 50 μL反應液進行PCR擴增。Giordano 等在2001 年采用聚酰亞胺材料制作單池 PCR芯片(如圖1A 所示) ，利用紅外加熱，在4 min 內完成了對長度為500 bp 的 DNA 片段的擴增。Neuzil 等采取以礦物油包裹 PCR溶液的方式，形成了液滴虛擬微池來實現(xiàn)擴增(如圖 1B 所示) ，可以有效減少反應溶液的揮發(fā)，他們設計的芯片能夠快速地升溫降溫，最后通過融解曲線分析和毛細管電泳兩種方法檢驗純度。微池陣列是在單反應池的基礎上增加反應通量得到。Matsubara 等在一塊長3英寸、寬1英寸的 硅片上刻蝕了1248 個微孔，每個微孔容積為50 nL( 如圖 1C 所示) 。PCR反應液用點樣儀加入每個微池，再用石蠟油密封。Cai 等則是將 PCR反應液通入芯片中，進行預載入，之后通過芯片多層之間的滑動使溶液進入微室陣列中，最后分別進行擴增與成像，免去了頻繁加樣的繁瑣操作。微池型 PCR的關鍵在于體系溫度的快速切換，需要優(yōu)化儀器的溫度控制來縮短循環(huán)時間，其次因為反應體積微小，需要精密的加樣儀器或是利用微流控芯片結構的特殊設計實現(xiàn)高通量。

圖1微池型 PCR芯片: (A) 單反應池 PCR芯片，(B) 液滴虛擬微池 PCR芯片， (C) 微池陣列 PCR芯片

2.蛇形通道 PCR芯片

蛇形通道PCR芯片由Kopp 等在1998年首次提出，蛇形通道 PCR芯片的經典形狀是平行式(如圖2A所示) ，隨后 Schaerli 等在 2009 年開發(fā)出了輻射式排布的蛇形通道芯片，同時結合了液滴技術，將納升級的 PCR反應液包裹在油相之中，沿著通道在溫區(qū)間循環(huán)。Jiang 等在 2014 年同樣設計了一款輻射式通道的芯片(圖2B)，利用太陽能加熱，并通過智能手機裝載的熒光檢測器檢測反應的進行。這種芯片的溫區(qū)一般以高溫–中溫–低溫的形式排布，加熱元件有Cu、Pt、Al等金屬或是ITO (indium tin oxide，銦錫氧化物) 電極等，為了提高芯片的溫度控制效率和3個溫區(qū)的精確控制，芯片還與溫度傳感器集成，并且通過熱隔離槽來降低溫區(qū)間的熱交換。雖然在一些特別的模板和引物條件下，PCR反應中的退火和延伸溫度可以一致，只需兩個溫區(qū)就可以進行 PCR擴增，但是3個溫區(qū) PCR芯片適用性更廣。然而3個溫區(qū)芯片存在的一個問題是，高溫區(qū)解鏈產物在經過中溫延伸區(qū)時可能會與 DNA 模板或互補鏈配對重新回到雙鏈狀態(tài)導致退火失敗，降低擴增效率。而更改溫區(qū)的排布會使得芯片的設計更為復雜。

圖2蛇形通道型 PCR芯片:(A) 平行通道 PCR芯片，(B) 輻射通道 PCR芯片

3.螺旋通道 PCR芯片

螺旋通道PCR芯片可以有效解決溫區(qū)布局的問題。在這類芯片中，3個溫區(qū)以扇形排布，反應溶液沿著通道盤旋流動，依次經過高低中3個溫區(qū)。DNA 的高溫變性產物直接進入低溫退火區(qū)，避免了在延伸區(qū)雙鏈復性的可能，提高擴增效率。螺旋通道 PCR芯片有平面式與圓柱式兩種，Hashimoto 等研制的 PCR芯片就是平面結構( 如圖3A 所示) ，他們設計的芯片分左右兩個區(qū)域。他們利用這款芯片對反應液流速進行了探索，最終可以分別在1.7和3.2 min內完成500 bp 及997 bp 的DNA片段的20次循環(huán)擴增與檢測。Park 等將一條長3.5 m 的彈性石英管在有3個溫區(qū)的圓柱加熱器上螺旋式纏繞33 周，實現(xiàn)了 PCR擴增。隨后 Dorfman 等也研制了類似的 PCR設備(如圖3B 所示) ，他們利用不混溶的氟化溶劑將反應液分隔成液滴的形式，借助對界面性質的優(yōu)化控制使得相鄰液滴不會相互污染，以達到高通量的目的。Shu 等采用空氣對液體片段進行隔離，發(fā)展了一種在螺旋通道微流控裝置上進行的高通量快速核酸擴增方法，可以在一個液滴里同時擴增4 種病原菌的靶基因，對實驗中涉及的4 種病原菌的基因組同時檢測的靈敏度可以達到100 copies/μL。

相比而言，平面式結構緊湊但每個循環(huán)的長度不一致，圓柱式體積比較大但是每個循環(huán)長度一致，流體控制較為簡便。蛇形通道與螺旋通道 PCR芯片的共同特點是，PCR的循環(huán)次數(shù)和時間受到整個通道的長度和流體速度的限制，一旦芯片結構固定，循環(huán)次數(shù)也相對固定。

圖3螺旋通道型 PCR裝置: ( A) 平面螺旋通道 PCR 裝置，( B) 圓柱螺旋通道 PCR裝置

4.振蕩式PCR芯片

振蕩式PCR是近年來隨著微流控技術不斷發(fā)展衍生的新方法。在振蕩式裝置中，循環(huán)次數(shù)不會受微通道長短限制。振蕩式PCR裝置由反應微通道、流體驅動器及加熱器組成。PCR溶液在驅動器的控制下在溫區(qū)間往復運動，循環(huán)次數(shù)可以隨意調節(jié)，在各個溫區(qū)的反應時間也可以通過改變各溫區(qū)的長度和流動速度來優(yōu)化(見圖4) 。Wang 等將1 μL PCR反應液以液滴的形式注入微通道中，反應液液滴兩端以石蠟油封裝，通過雙向蠕動泵的控制使液滴在 3 個溫區(qū)中循環(huán)，可以在15 min 內完成對人乳頭瘤細菌 DNA 的擴增。隨后，其他研究者們也設計了類似的芯片對黑色素瘤相關的酪氨酸酶基因，沙門氏菌、大腸桿菌、李斯特菌等以及食物來源的病原體的 DNA 進行了檢測。

振蕩式 PCR芯片與蛇形通道式 PCR芯片有個共同點是，PCR反應溶液在循環(huán)過程中不得不在高溫變性后穿過延伸區(qū)，才能來到退火區(qū)，但是通過流體驅動器的調節(jié)，可以盡量縮短這段過程的時間，避免DNA雙鏈復性。

圖4 振蕩型 PCR裝置

5.閉環(huán)式PCR芯片

閉環(huán)式 PCR芯片的原理與平面螺旋式 PCR芯片類似，同樣是通過驅動 PCR溶液在平面內的環(huán)形通道內循環(huán)流過3個溫區(qū)實現(xiàn)擴增反應。反應溶液依次經過高低中3個溫區(qū)，避免了 DNA 復性影響擴增效率。根據驅動液體流動的原理可以分為溫差環(huán)流、對流驅動和外力(如浮力、磁力、壓力等) 驅動的閉環(huán) PCR。與螺旋式 PCR不同的是，閉環(huán)式 PCR每個循環(huán)都是在同一個環(huán)形通道中進行，因此每次循環(huán)的長度是一致的，芯片體積小，利于集成化和平行化高通量擴增。Krishnan 等首次開發(fā)了一種利用雷諾–貝納爾( RayleighBenard) 自然對流驅動方式進行的 PCR設備(如圖5A 所示) ，PCR反應液在61℃和97℃的密閉空間內往復流動， DNA 的擴增效率會受到雷諾數(shù)(Ra) 和密閉腔體的高度與直徑的比值( h/d) 的影響。Sun等將多個閉環(huán)通道合并在一塊芯片內(如圖 5B 所示) ，利用中心的磁鐵同時對四重閉環(huán)內的磁性流體進行操縱，磁性流體繼而推動反應液在環(huán)內流動，循環(huán)通過3個溫區(qū)。Xu 等通過 ITO 電極加熱控制3 個溫區(qū)的溫度，采用壓縮氮氣作為驅動力，氣體的釋放由開關控制，反應液在通道內的移動同時需要微閥的配合(如圖5C 所示) 。在這種設計的 PCR芯片中，反應時間、循環(huán)次數(shù)、反應溫度都是可以根據實際要求設置的，大大提高了芯片的適用性。

圖5 閉環(huán)型 PCR設備: (A) 雷諾-貝納爾對流驅動式閉環(huán) PCR 裝置; (B) 磁流體驅動式閉環(huán) PCR裝置;(C) 壓力驅動式閉環(huán) PCR 裝置

二、芯片 PCR 產物的檢測與分析

在只具有擴增功能的 PCR芯片中，反應完成后，擴增產物一般采用離線的凝膠電泳、毛細管電泳等分離檢測方法進行驗證，這與傳統(tǒng) PCR儀相比并沒有優(yōu)勢，在線的檢測方法在提高檢測通量、減少交叉污染的風險等方面更具有前景，因此發(fā)展功能集成化的芯片也是研究者追求的方向。

毛細管電泳法

毛細管電泳(Capillary electrophoresis，CE) 的原理是擴增產物在進入檢測通道前，先通過嵌入型染料進行標記，隨后在電場的驅動下遷移運動，因不同片段長度的 DNA 分子遷移速度不同而被分離。檢測器有紫外、熒光等。將 PCR與毛細管電泳結合最早是由 Mathies 課題組在1996 年提出，他們將硅片PCR芯片與玻璃毛細管電泳芯片通過環(huán)氧樹脂連接在起一次， PCR擴增后的產物經芯片的十字交叉口注入分離通道進行電泳。他們隨后又利用類似的方法對人類基因組 DNA 進行擴增并且可以對性別進行鑒定;之后還對病原微生物的 DNA 進行了檢測，檢出限可以低至2～3個細菌。近年來，PCR與CE的結合也逐漸朝著集成化的方向發(fā)展。毛細管電泳因為結構簡單、分析迅速，是最常用的分離檢測方法，然而它的缺陷在于只能分辨 DNA 序列的大小而無法區(qū)分 DNA 序列的不同。

熒光檢測法

熒光檢測法也是目前微流控 PCR芯片中常用的檢測方法之一。研究者將芯片與熒光成像系統(tǒng)結合，不但可以在終點進行產物檢測，還可以借助熒光探針和芯片結構實時監(jiān)測反應的進行過程。熒光終點檢測一般用于判斷 PCR的成功與否或進行半定量分析，但是實時熒光檢測則可以通過循環(huán)閾值的方法進行準確的定量分析。然而循環(huán)閾值定量方法會受到擴增效率的影響，Vogelstein 等在1999 年提出了數(shù)字PCR( digital PCR) 的概念，通過將樣本分配到成百上千個反應單元中，每個單元只包含一個或多個拷貝的DNA分子，在每個反應單元中分別進行PCR擴增，擴增結束后對各個單元的熒光信號進行統(tǒng)計學分析，最終獲得定量結果。反應單元越多，數(shù)字PCR的結果越準確，且不會受到擴增效率的影響。微池型 PCR芯片與熒光檢測相結合，進行數(shù)字PCR是目前的研究熱點之一。

在線熒光檢測除終點檢測、實時檢測，還包括熒光融解曲線分析。這是一種可以與實時熒光 PCR有機結合的檢測技術，在 PCR結束后，利用現(xiàn)有的溫度梯度，從退火溫度緩慢升溫至變性溫度即可完成，具有靈敏、準確，且可以防止污染的優(yōu)點。Crews 課題組采用這種分析技術，在 20 min內完成了對人類唾液中的 DNA 的擴增與唾液來源的性別確認。

電化學方法

電化學方法是一種通過對電極的功能化修飾( 如固定探針、酶、適配體等) ，特異性地捕捉目標擴增產物，產生相應的電信號(電壓、電流、電阻) 的檢測手段，具有靈敏性高、成本低等優(yōu)點，而且可以通過微加工技術集成在微流控芯片上，因此最近也被發(fā)展用于 PCR產物檢測。Fang等將蛇形通道 PCR芯片與電化學檢測相結合，在退火溫區(qū)集成了三電極陣列，對每個循環(huán)進行實時的產物檢測。電化學方法中所用到的探針可以是特定序列的一段核酸多聚物，通過與目標產物的特異性結合產生電信號的改變，因此電化學方法可以在一定程度上分辨產物的核酸序列。

DNA 雜交微陣列

DNA 雜交微陣列是針對特定序列產物的一種檢測手段，可以對擴增產物序列進行分析。通 過精細的微加工技術，可以將 PCR芯片與固定有大量寡核苷酸探針的微陣列相結合，PCR產物與探針完全互補，二者結合后則會產生熒光圖樣，通過這些熒光圖樣就可以獲得擴增產物的序列信息。研究者們通過 DNA 雜交微陣列的方法在低豐度的 DNA 突變檢測、流感病毒檢測、 HIV 病毒基因分型等方面進行了探索。

三、微流控 PCR芯片分析應用實例

隨著微機電加工技術（MEMS）的快速發(fā)展，微流控 PCR芯片也在向結構簡單化、功能集成化、便攜式、一次性的方向發(fā)展，目前已有不少文獻報道了可以在線完成完整的生物樣本分離與分析的裝置，為生物學和醫(yī)藥學等學科的研究帶來了很多應用價值。

Sciancalepore 等在2011 年構建了一款振蕩型 PCR芯片，也是第一款巢式 PCR芯片。芯片由PDMS與玻璃基質兩層鍵合而成，PDMS中包裹有一根玻璃毛細管，作為 PCR反應的通道。毛細管中填充了硅化試劑玻璃基質表面通過電子束蒸發(fā)沉積的方式設置了3個鈦/鉛復合電極，作為微加熱器，并與溫度傳感器結合，分別控制 PCR過程中需要的3個溫度，升/降溫速度可以達到16℃/s。反應液滴通過毛細管兩端的流體泵控制，在3個溫區(qū)間循環(huán)。巢式 PCR的特點在于引物包括內外兩套，外引物完成第一次 PCR后的產物作為內引物的模板，進行第二次 PCR。這種擴增方式的特異性和靈敏性都明顯高于普通的PCR。利用這款巢式PCR芯片在55 min 內完成對酪氨酸激酶基因的擴增，可以用于惡性黑色素瘤的診斷，比傳統(tǒng) PCR儀的速度提高了4 倍。

Tian 等提出了一款利用負壓協(xié)助完成 DNA 純化和數(shù)字 PCR檢測的微流控芯片。芯片分為 DNA純化區(qū)與數(shù)字PCR區(qū)，以磁珠吸附生物樣品裂解液中的DNA，并在磁鐵的幫助下固定在純化區(qū)， 經過兩步清洗后，從磁珠上洗脫，與PCR試劑混合，再借助負壓使溶液流入PCR區(qū)的微孔陣列中后，用硅油與未凝固的PDMS 混合物沖走多余的樣品，在溫度循環(huán)的過程中，未固化的PDMS 混合物也會逐漸凝固，起到封鎖進樣通道的作用。氣壓控制通道則注入水，使PCR區(qū)域保持濕潤，避免試劑的蒸發(fā)。擴增完成后，通過對每個微孔中熒光強度的統(tǒng)計以及樣品的稀釋倍數(shù)可以對樣品濃度進行定量。數(shù)字 PCR的關鍵在于需要將樣品溶液分配至成百上千個單獨的反應孔中，使每個孔里只含有1～2個 DNA 模板或是沒有，這款芯片利用了 PDMS 的透氣性，在芯片外用注射器抽吸，使空腔內形成負壓，從而完成了樣品溶液的分配，擺脫了對自動加樣器的依賴。

微流控 PCR芯片的形式從最初單個微池或是簡單的蛇形通道逐漸變得越來越豐富，并且在微閥、微泵等功能元件的組合下，功能也越來越完善，研究者們的思維也在逐步地擴展，出現(xiàn)了許多巧妙的設計。但是芯片的結構并非越復雜越好，繁瑣的流體操作會耗費大量時間，也會對芯片制作帶來麻煩，因此在完成實驗目的的前提下，盡量簡化芯片結構才是重點。

目前， PCR芯片在流體操作方面已經基本由機械化自動化的流體泵來完成，為了擺脫對流體泵的依賴，也有研究者提出了一些利用材料的表面張力自驅動的芯片，在樣品制備方面也出現(xiàn)了不少可以直接利用功能結構在線提取和純化的芯片，然而在在線檢測方面仍舊有待改進。熒光檢測是最為便捷和靈敏的檢測手段，但是需要依賴于昂貴的光學儀器和攝像設備，毛細管電泳與凝膠電泳則相對廉價但是受到精度和靈敏度的限制，離線檢測耗時耗力又易引入污染。所以，發(fā)展一種能夠在線檢測，且低成本、高速度、高通量的檢測方法，是今后的研究重點，可以向電化學生物傳感器的方向考慮。

我們相信在更為精細的微機電加工、更為準確的溫度與流體控制、更為靈敏的數(shù)碼影像分析下，微流控芯片的制作會越來越精巧，PCR的操作會更高效和便捷，基因分析的結果會更穩(wěn)定和豐富?；谖⒘骺匦酒耐怀鰞?yōu)點和人們對新技術新方法的需求，微流控 PCR芯片將在今后的基因研究中逐漸占據一席之地。

微流控 PCR芯片的形式從最初單個微池或是簡單的蛇形通道逐漸變得越來越豐富，并且在微閥、微泵等功能元件的組合下，功能也越來越完善，研究者們的思維也在逐步地擴展，出現(xiàn)了許多巧妙的設計。但是芯片的結構并非越復雜越好，繁瑣的流體操作會耗費大量時間，也會對芯片制作帶來麻煩，因此在完成實驗目的的前提下，盡量簡化芯片結構才是重點。

目前， PCR芯片在流體操作方面已經基本由機械化自動化的流體泵來完成，為了擺脫對流體泵的依賴，也有研究者提出了一些利用材料的表面張力自驅動的芯片，在樣品制備方面也出現(xiàn)了不少可以直接利用功能結構在線提取和純化的芯片，然而在在線檢測方面仍舊有待改進。熒光檢測是最為便捷和靈敏的檢測手段，但是需要依賴于昂貴的光學儀器和攝像設備，毛細管電泳與凝膠電泳則相對廉價但是受到精度和靈敏度的限制，離線檢測耗時耗力又易引入污染。所以，發(fā)展一種能夠在線檢測，且低成本、高速度、高通量的檢測方法，是今后的研究重點，可以向電化學生物傳感器的方向考慮。

我們相信在更為精細的微機電加工、更為準確的溫度與流體控制、更為靈敏的數(shù)碼影像分析下，微流控芯片的制作會越來越精巧，PCR的操作會更高效和便捷，基因分析的結果會更穩(wěn)定和豐富?；谖⒘骺匦酒耐怀鰞?yōu)點和人們對新技術新方法的需求，微流控 PCR芯片將在今后的基因研究中逐漸占據一席之地。

微流控 PCR芯片的形式從最初單個微池或是簡單的蛇形通道逐漸變得越來越豐富，并且在微閥、微泵等功能元件的組合下，功能也越來越完善，研究者們的思維也在逐步地擴展，出現(xiàn)了許多巧妙的設計。但是芯片的結構并非越復雜越好，繁瑣的流體操作會耗費大量時間，也會對芯片制作帶來麻煩，因此在完成實驗目的的前提下，盡量簡化芯片結構才是重點。

四、總結與展望

目前， PCR芯片在流體操作方面已經基本由機械化自動化的流體泵來完成，為了擺脫對流體泵的依賴，也有研究者提出了一些利用材料的表面張力自驅動的芯片，在樣品制備方面也出現(xiàn)了不少可以直接利用功能結構在線提取和純化的芯片，然而在在線檢測方面仍舊有待改進。熒光檢測是最為便捷和靈敏的檢測手段，但是需要依賴于昂貴的光學儀器和攝像設備，毛細管電泳與凝膠電泳則相對廉價但是受到精度和靈敏度的限制，離線檢測耗時耗力又易引入污染。所以，發(fā)展一種能夠在線檢測，且低成本、高速度、高通量的檢測方法，是今后的研究重點，可以向電化學生物傳感器的方向考慮。

我們相信在更為精細的微機電加工、更為準確的溫度與流體控制、更為靈敏的數(shù)碼影像分析下，微流控芯片的制作會越來越精巧，PCR的操作會更高效和便捷，基因分析的結果會更穩(wěn)定和豐富?；谖⒘骺匦酒耐怀鰞?yōu)點和人們對新技術新方法的需求，微流控 PCR芯片將在今后的基因研究中逐漸占據一席之地。

內容來源：何啟迪黃丹萍黃冠陳纘光《微流控 PCR芯片的研究進展》（轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯(lián)系刪除）