1.單細(xì)胞測(cè)序概論

過(guò)去二十幾年里，隨著基因測(cè)序技術(shù)水平的提高以及千人基因組計(jì)劃、癌癥基因組計(jì)劃、Meta-Hit計(jì)劃等重大國(guó)際合作項(xiàng)目的相繼開(kāi)展，基因組研究日漸被推向高潮。以“高通量”為特點(diǎn)的第二代測(cè)序( next generation sequencing,NGS) 技術(shù)和以“單分子測(cè)序”為標(biāo)志的第三代測(cè)序( third generation sequencing,TGS)技術(shù),引起組學(xué)研究領(lǐng)域的巨大變革。高通量測(cè)序儀能夠?qū)资f(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子同時(shí)測(cè)序,精確讀出數(shù)以千億計(jì)( 每1次run) 的堿基,實(shí)現(xiàn)了快速、高效、低成本的基因組尺度測(cè)序。一般地,高通量測(cè)序需要從大量細(xì)胞中獲取足夠的DNA樣品,因此測(cè)序結(jié)果是這些細(xì)胞“整體”的一個(gè)表征。然而,由于細(xì)胞異質(zhì)性,相同表型的細(xì)胞的遺傳信息可能存在顯著性差異,很多低豐度的信息會(huì)在整體表征中丟失。例如,實(shí)體瘤樣本中提取的總DNA,50% 以上來(lái)源于非癌性成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞,使得癌細(xì)胞的信號(hào)可能被隱藏。另外,自然界中存在大量的難以培養(yǎng)富集的微生物,例如在人體中,90% 以上的微生物都是不能進(jìn)行體外培養(yǎng)的。由于細(xì)胞數(shù)目有限,這些微生物的序列信息則很難通過(guò)傳統(tǒng)高通量測(cè)序獲得。作為“在單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序”的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠解決上述難題。與傳統(tǒng)的全基因組測(cè)序相比，單細(xì)胞測(cè)序不僅測(cè)量基因表達(dá)水平更加精確，而且還能檢測(cè)到微量的基因表達(dá)子或罕見(jiàn)非編碼RNA，其優(yōu)勢(shì)是全方位和多層次的。2011年，《自然方法》雜志( Nature Methods )將單細(xì)胞測(cè)序列為年度值得期待的技術(shù)之一，2013年，《科學(xué)》雜志（Science）將單細(xì)胞測(cè)序列為年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首。目前,單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)已經(jīng)初步應(yīng)用到了海洋微生物多樣性以及癌癥患者體細(xì)胞突變多樣性的研究中。我國(guó)在單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)域處于國(guó)際領(lǐng)先水平,深圳華大基因率先建立了單細(xì)胞外顯子組測(cè)序技術(shù),應(yīng)用于骨髓增殖性腫瘤和腎透明細(xì)胞癌的研究中,在單個(gè)細(xì)胞的水平上解析了瘤內(nèi)細(xì)胞遺傳異質(zhì)性,為癌癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及診斷治療開(kāi)辟了新方向,并為其他類型腫瘤的研究提供了新思路。

2.單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的原理

單細(xì)胞測(cè)序主要包括單細(xì)胞基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和表觀遺傳測(cè)序,這3種測(cè)序類型各具特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì),可以從不同角度揭示細(xì)胞各個(gè)階段的功能和特性。全基因組測(cè)序是對(duì)目的細(xì)胞的全部基因組序列進(jìn)行非選擇性、均勻擴(kuò)增,隨后利用外顯子捕獲技術(shù)進(jìn)而使用高通量測(cè)序的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序則是獲取特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本,尤其適用于具有高度異質(zhì)性的干細(xì)胞及胚胎發(fā)育早期的細(xì)胞群體的研究。以NGS為基礎(chǔ)的各種表觀遺傳學(xué)測(cè)序可揭示基因調(diào)控的不同方面,包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白、染色體的空間結(jié)構(gòu)與空間相互作用形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組分。表觀遺傳改變是可逆的,并決定基因表達(dá)和負(fù)責(zé)細(xì)胞的異質(zhì)性。

3.單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的流程

細(xì)胞測(cè)序主要涉及4大步驟,包括單細(xì)胞分離、核苷酸序列(DNA或RNA)擴(kuò)增、基因測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。

單細(xì)胞分離

要對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行研究,首先要將目的細(xì)胞從生長(zhǎng)環(huán)境中分離出來(lái),并確保其生物完整性。目前常用的單細(xì)胞分離方法有連續(xù)稀釋法、顯微操作法、激光捕獲顯微切割術(shù)( laser capture microdissection,LCM)、拉曼鑷子技術(shù)( Raman tweezers)、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)( fluorescence activated cell sorting,FACS)和微流控技術(shù)( microfluidics)等。連續(xù)稀釋法操作簡(jiǎn)單、成本低廉,主要通過(guò)連續(xù)稀釋樣品來(lái)獲取單個(gè)細(xì)胞。其缺點(diǎn)在于,容易出現(xiàn)分離錯(cuò)誤或細(xì)胞丟失,不能進(jìn)行靶向分離。因此,該技術(shù)很少用于復(fù)雜微生物樣品的單細(xì)胞分離。顯微操作法是借助機(jī)械顯微操縱儀或可視化鑷子分離單個(gè)細(xì)胞。這種方法不僅操作簡(jiǎn)單、成本低廉,而且能夠進(jìn)行可視化操作,目前已經(jīng)應(yīng)用到許多難以培養(yǎng)微生物的單細(xì)胞分離中,例如從白蟻腸道中分離共生體,從水稻土壤中分離蒼白桿菌( Ochrobactrum)等。顯微操作法雖然實(shí)現(xiàn)了可視化分離,但是人力投入大和通量較低等不足限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用;另外,該技術(shù)還會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性損傷。激光捕獲顯微切割術(shù)( LCM)能夠直接從組織塊中分離單個(gè)細(xì)胞,廣泛應(yīng)用于臨床研究中。該技術(shù)首先將組織進(jìn)行切片、裝片和染色處理,進(jìn)而通過(guò)可視化操作分離單細(xì)胞。其優(yōu)勢(shì)在于,能夠保持細(xì)胞的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu),保留細(xì)胞在組織中的空間位置信息。但是其劣勢(shì)在于,細(xì)胞核容易被刨切而導(dǎo)致染色體片段丟失;另外,該技術(shù)由于精確度有限,切割過(guò)程中會(huì)不可避免的摻入相鄰細(xì)胞的原生質(zhì)組分,因此不適用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。拉曼鑷子技術(shù)結(jié)合了拉曼顯微光譜學(xué)和光學(xué)捕獲技術(shù),前者能夠通過(guò)輪廓區(qū)分細(xì)胞而無(wú)需染色,后者利用激光捕獲細(xì)胞。但這種方法僅限于分析形態(tài)學(xué)差異較大的細(xì)胞群。

目前單個(gè)腫瘤細(xì)胞分離通常是通過(guò)磁珠激活細(xì)胞分選(magnetic-activated cell sorting,MACS)或熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence-activated cell sorting,FACS)技術(shù)進(jìn)行。這兩種分離方法的成本較高,但是能滿足高通量、自動(dòng)化的要求。免疫磁珠分離法(immunomagnetic separation,IMS)屬于MACS技術(shù),即利用細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合。在外加磁場(chǎng)中,與磁珠相連的帶有表面抗原的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中,不能與磁珠連接的細(xì)胞不在磁場(chǎng)中停留,從而使目的細(xì)胞得以快速分離,但操作方法相對(duì)復(fù)雜。

熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)是目前應(yīng)用最多的單細(xì)胞分離方法,可對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行高效和快速分離。FACS平臺(tái)通過(guò)依靠熒光標(biāo)記信號(hào)結(jié)合光散射分析參數(shù),對(duì)具有異質(zhì)性的腫瘤組織的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行挑選和分析。該法不僅具備高通量的優(yōu)勢(shì),而且可對(duì)具有不同表征(如大小、粒度、特異性抗原標(biāo)記、同位素標(biāo)記等)的靶細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和分離。其最大的缺陷是分選時(shí)需要大量的細(xì)胞,因此在制備大量細(xì)胞懸液的過(guò)程中可能降低低豐度細(xì)胞的獲取率;同時(shí)FACS所檢測(cè)的熒光信號(hào)相對(duì)較低,部分低表達(dá)的標(biāo)記可能檢測(cè)困難,存在特定細(xì)胞類型丟失的風(fēng)險(xiǎn);此外,細(xì)胞的高速流動(dòng)可能造成機(jī)械性損傷。

另一個(gè)新發(fā)展的微流控技術(shù)(microfluidics)則是通過(guò)人為控制流體流動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)在微尺度上對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行分離,主要利用流控通道具備的多種功能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選,如通道本身具有可調(diào)節(jié)的直徑(10~100μm)和多種功能性修飾(如捕獲分子、抗體、電極等)。同時(shí)微流控裝置的細(xì)胞污染率低,對(duì)樣本和試劑損耗少,并且在降低單細(xì)胞測(cè)序的噪聲以及提高基因組擴(kuò)增一致性方面具有優(yōu)勢(shì),已有相應(yīng)的商業(yè)化平臺(tái)在推廣應(yīng)用。

細(xì)胞溶解與基因組DNA獲取

分離得到單細(xì)胞后,需要將細(xì)胞進(jìn)行溶解來(lái)獲取基因組DNA( genome DNA,g DNA)。這一步驟非常關(guān)鍵,g DNA的質(zhì)量直接影響后續(xù)基因組擴(kuò)增的效果。目前細(xì)胞溶解的方法可以分為3大類:物理法( 如超聲、冷凍、研磨、剪切、高壓和熱破壞法)、化學(xué)法( 如SDS、triton X-100和極端pH)和酶降解法( 如蛋白酶K和溶菌酶)。細(xì)胞溶解方法的選定,需要綜合考慮多方面因素,如細(xì)胞的類型、下游用途、g DNA純化難易程度等。

在傳統(tǒng)高通量測(cè)序流程中,細(xì)胞溶解獲得的g DNA需要通過(guò)進(jìn)一步純化后才能用于擴(kuò)增。但是對(duì)于單細(xì)胞測(cè)序,為了避免g DNA在純化過(guò)程中丟失,目前大部分流程已經(jīng)省去了這一步驟。在某些基因組中,各位點(diǎn)僅存在1個(gè)拷貝,純化過(guò)程中的樣品丟失會(huì)直接導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物中的位點(diǎn)缺失,嚴(yán)重影響后續(xù)的基因組重建。g DNA純化步驟的省略,對(duì)細(xì)胞溶解操作提出了更加苛刻的要求,那些可能與基因組擴(kuò)增試劑相互作用的溶解試劑都應(yīng)當(dāng)避免使用。另外,DNA結(jié)合蛋白通常會(huì)阻礙模板擴(kuò)增,需要事先將其切割或變性;蛋白酶(如蛋白酶K和胰蛋白酶)可以高效地溶解DNA結(jié)合蛋白,目前廣泛用于待擴(kuò)增模板的預(yù)處理中。

全基因組擴(kuò)增(WGA)

高通量測(cè)序至少需要200 ng的DNA樣品,而1個(gè)細(xì)胞中的總DNA一般僅有數(shù)匹克,即使使用第3代測(cè)序技術(shù)可能也無(wú)法滿足樣品量的需求,因此WGA對(duì)于單細(xì)胞測(cè)序是非常必要的。全基因組擴(kuò)增技術(shù)主要分為兩種類型：一是基于熱循環(huán)以PCR為基礎(chǔ)的擴(kuò)增技術(shù)，如簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR)、連接反應(yīng)介導(dǎo)的PCR (LM-PCR)、擴(kuò)增前引物延伸反應(yīng)(PEP)等；一是基于等溫反應(yīng)不以PCR為基礎(chǔ)的擴(kuò)增技術(shù)，如多重置換擴(kuò)增(MDA)和基于引物酶的全基因組擴(kuò)增(pWGA)。

在這兩種類型中，PCR擴(kuò)增比較經(jīng)典，但是，對(duì)不同的序列來(lái)說(shuō)，PCR擴(kuò)增的效率存在相當(dāng)大的偏差，易產(chǎn)生擴(kuò)增偏倚問(wèn)題：如富含CG的DNA序列和相應(yīng)基因座位的非隨機(jī)丟失，等位基因的非隨機(jī)丟失，以及與DNA片段大小相關(guān)的偏差（傾向于擴(kuò)增更多短片段），尤其是在應(yīng)用于單細(xì)胞時(shí)，大量短片段導(dǎo)致片段間序列丟失，從而使其應(yīng)用受限。

MDA是目前公認(rèn)的最好的單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)，它能對(duì)全基因組進(jìn)行高保真的均勻擴(kuò)增，擴(kuò)增出10~100kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因組序列。但是MDA也有一些缺點(diǎn)，特別是顯著的非特異擴(kuò)增。另外就是全基因組覆蓋度不均勻;等位基因丟失率高(可高達(dá)65%);污染或干擾;隨機(jī)引物與模板結(jié)合能力差異導(dǎo)致的擴(kuò)增偏倚。針對(duì)MDA潛在的污染問(wèn)題(包括外源性或交叉污染),目前主要采取的改進(jìn)措施是將熒光標(biāo)記(例如SYBR Green)摻入反應(yīng)體系中,以便對(duì)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行可視化的熒光監(jiān)測(cè)。該技術(shù)已成功應(yīng)用于腫瘤單細(xì)胞測(cè)序;另一項(xiàng)極具創(chuàng)新性的技術(shù)MALBAC是由哈佛大學(xué)謝曉亮團(tuán)隊(duì)研發(fā)。與以前的技術(shù)相比,MALBAC的最大優(yōu)勢(shì)是采用線性擴(kuò)增方式。其核心技術(shù)在于通過(guò)五輪MDA預(yù)擴(kuò)增得到完整擴(kuò)增產(chǎn)物;增加退火步驟達(dá)到鏈內(nèi)雜交自我鎖定,形成閉合的環(huán)狀分子,避免指數(shù)擴(kuò)增;再通過(guò)常規(guī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。由于此時(shí)的模板更加均一,則可達(dá)到低偏倚的目的。

基因組測(cè)序數(shù)據(jù)及生物信息分析

對(duì)高通量數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)解讀是基因測(cè)序和精準(zhǔn)醫(yī)療的關(guān)鍵。單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析的基本流程與傳統(tǒng)序列分析相似,數(shù)據(jù)分析前首先要移除接頭序列(adapter)、連接序列(linker)、標(biāo)簽序列(barcodes)、低質(zhì)量堿基和污染DNA。然而兩者間具有顯著差異,傳統(tǒng)拼接方法是建立在一定的假設(shè)之上,如嵌合序列比例較少,讀取深度隨基因組呈泊松分布等。而單細(xì)胞數(shù)據(jù)由于表現(xiàn)出不均勻的覆蓋度和高比例的嵌合序列,則需要采用不同的分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。一種方法是通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法或計(jì)算機(jī)算法將核酸文庫(kù)“標(biāo)準(zhǔn)化”,以降低擴(kuò)增偏倚性;另外一種方法是將親緣關(guān)系很近的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行混合分析。從偏倚性的角度來(lái)看,混合分析可以顯著地提高樣品的平均覆蓋度。同時(shí)生物信息學(xué)分析軟件也為數(shù)據(jù)分析提供了極大的便利,如Smash Cell、Velvet-SC和SPAdes軟件等都能在一定程度上克服單細(xì)胞數(shù)據(jù)覆蓋度不均的問(wèn)題,高效地完成序列拼接與測(cè)序數(shù)據(jù)分析。

SCS技術(shù)在腫瘤檢測(cè)中的應(yīng)用

已有的研究表明，基因或基因組變異是腫瘤發(fā)生的根本原因，利用單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)，可以對(duì)獲取的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行更為精確和深入的分析，發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞差異，了解癌細(xì)胞的基因如何突變，以及腫瘤的來(lái)源、腫瘤的生長(zhǎng)規(guī)律、屬于哪種基因型等，為早期檢測(cè)和診斷腫瘤和腫瘤的個(gè)體化治療提供指導(dǎo)。另外，腫瘤的異質(zhì)性是導(dǎo)致腫瘤耐藥性問(wèn)題的原因。如果能從單個(gè)腫瘤細(xì)胞水平對(duì)腫瘤單細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，并找出一個(gè)腫瘤在單個(gè)細(xì)胞上的共同結(jié)構(gòu)，揭露出每個(gè)腫瘤細(xì)胞的突變規(guī)律，這將為藥物研究、腫瘤的靶向治療提供基礎(chǔ)。

2008年，美國(guó)華盛頓醫(yī)學(xué)院的Ley等完成了對(duì)一位50多歲死于急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)的患者的基因組測(cè)序工作。他們利用高級(jí)流式細(xì)胞術(shù)分離出細(xì)胞表面CD13、CD33和CD117陽(yáng)性，但CD34陰性的腫瘤細(xì)胞，并檢測(cè)它的遺傳突變。最終在患者的腫瘤DNA中僅發(fā)現(xiàn)了10個(gè)可能與AML有關(guān)的遺傳突變，其中8個(gè)很罕見(jiàn)，這也是首次發(fā)現(xiàn)的與AML有關(guān)的基因。通過(guò)單細(xì)胞分析技術(shù)，測(cè)得每個(gè)腫瘤樣本細(xì)胞擁有9個(gè)突變。

2011年，Navin等利用DOP全基因組擴(kuò)增及DNA測(cè)序?qū)蝹€(gè)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行了拷貝數(shù)變異的分析，進(jìn)而推斷出細(xì)胞的群體結(jié)構(gòu)和腫瘤的進(jìn)化過(guò)程。但是由于該方法的基因覆蓋率較低，而且不能在單個(gè)核苷酸的分辨率上評(píng)價(jià)單個(gè)腫瘤細(xì)胞的遺傳學(xué)特征，故并不能檢測(cè)在腫瘤發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用的單個(gè)核苷酸的改變。

2012年，華大基因首次利用以MDA為基礎(chǔ)的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia, ET)病人的單個(gè)骨髓細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序并分析，篩查出在ET發(fā)病和進(jìn)展中的驅(qū)動(dòng)基因, 從而證實(shí)ET為單克隆來(lái)源的疾病。同時(shí)，也將該方法與經(jīng)典方法進(jìn)行比較，從而建立了具有高敏感性、高特異性、假陽(yáng)性率低等特點(diǎn)的單細(xì)胞測(cè)序方法，為分析疾病的遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)特征及克 隆進(jìn)化過(guò)程提供了新的思路。同樣的方法也用于分析單個(gè)腎癌細(xì)胞的單核苷酸突變特征，從而在更高的分辨能力上為評(píng)價(jià)基因改變的復(fù)雜性提供了更為優(yōu)化的方法。

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（文章來(lái)源: 南開(kāi)細(xì)胞工程 作者：李思宇  科學(xué)網(wǎng)科學(xué)網(wǎng)轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）