1.微流體學(xué)之前一段歷史

今天，微流控技術(shù)是一個獨特和主要的技術(shù)領(lǐng)域，但20多年前它并不像這樣，它的界限也沒有那么明確。微流體學(xué)的歷史與其他幾個領(lǐng)域密切相關(guān)。在微流體學(xué)是一門獨立的科學(xué)之前，通過借助這些領(lǐng)域的方法和材料來促進其興起和發(fā)展。這就是為什么在談到微流體學(xué)的發(fā)展時，你會遇到與該領(lǐng)域沒有直接聯(lián)系的詞匯和名稱，但卻是理解其起源的基礎(chǔ)。在第一個故事中，我們決定談?wù)摷呻娐泛凸饪碳夹g(shù)，這兩種“舊”技術(shù)是在微流體學(xué)之前誕生的，但經(jīng)常被用來促進其增長。

微流控時間表。附圖說明（時間順序）:( a）PDMS化學(xué)結(jié)構(gòu); （b）道康寧公司成立于米德蘭（1943年），從事有機硅工作（圖像來源 - IHS媒體）; （c）由Jack Kilby（1958）創(chuàng)建的第一個工作鍺IC（圖片來自德州儀器）; （d）通過復(fù)制成型獲得的圖案化PDMS微結(jié)構(gòu)的SEM圖像[8]。（e）PDMS微流體芯片。PDMS是由Whitesides在1998年作為微流體材料引入的; （f）用于操縱和控制離散液滴和氣泡的數(shù)字微流體; （g）器官芯片的一個例子，這是一種允許細(xì)胞接種以重建特定人體組織或器官的微環(huán)境和微結(jié)構(gòu)的裝置; （h）紙質(zhì)微流體裝置可用作低成本，便攜式診斷工具，因此在緊急情況和資源有限的地區(qū)特別有用。

集成電路技術(shù)之父

集成電路（IC）技術(shù)和光刻技術(shù)的發(fā)展齊頭并進。集成電路的第一次發(fā)展是在1949年由德國工程師維爾納·雅克比(Werner Jacobi)和幾年后由英國雷達科學(xué)家杰弗里·杜默(Geoffrey Dummer)完成的。然而，Jack Kilby和Robert Noyce被認(rèn)為是集成電路技術(shù)的共同發(fā)明人，盡管他們分別工作(圖1和圖2)。

圖1. Robert Noyce和硅基集成電路。

1958年，杰克·基爾比(Jack Kilby)開始在德克薩斯儀器公司(Texas Instruments)的微型模塊項目中工作。該項目由美國陸軍信號部隊(US Army Signal Corps)贊助，其目標(biāo)是用集成電線創(chuàng)造出統(tǒng)一大小和形狀的組件，這些集成電線可以很容易地組裝成電路。那年夏天，Kilby沒有假期，開始獨自在實驗室里工作，開發(fā)出一種想法，即可以在同一塊半導(dǎo)體材料上制造無源(電阻和電容)和有源(晶體管)組件。同年9月，他展示了第一個鍺制集成電路。在Kilby的發(fā)明獲得專利六個月后，物理學(xué)家和Fairchild Semiconductor聯(lián)合創(chuàng)始人Robert Noyce認(rèn)識到鍺作為集成電路材料的局限性，開始研究硅集成電路，這就是為什么集成電路有兩個父親的原因。這一發(fā)現(xiàn)從根本上改變了社會，它被用于制造用于醫(yī)療、交通、娛樂和通信領(lǐng)域的計算機和電子設(shè)備，并使阿波羅登月計劃等成為可能。

圖2. Jack Kilby展示了1982年的集成電路。

1.光刻技術(shù)

光刻技術(shù)是在20世紀(jì)50年代早期發(fā)明的，當(dāng)時美國國家標(biāo)準(zhǔn)局（NBS, then US Army Diamond Ordinance Fuze Laboratory, DOFL）推動了一項計劃，以開發(fā)新的方法，獲得可以輕松集成到military proximity fuzes中的小型電子電路。從1952年起，Jay Lathrop和James R. Nall開始使用光刻膠來制作鍺。他們通過特殊改良的三目顯微鏡投射光線。因此，他們創(chuàng)造了一種鍺晶體管，可以很容易地集成到小型化的晶體管-陶瓷混合電路中。Lathrop和Nall寫了一篇論文，并在1958 - 1959年為他們的發(fā)現(xiàn)申請了專利，創(chuàng)造了photolithography這個詞。拉斯羅普自己宣稱：操作實際上是involved etching，而不是lithography。然而，photolithography聽起來比photoetching要高級，這個不恰當(dāng)詞一直沿用至今。Lathrop和Nall并不是唯一研究這一課題的研究人員。從1955年起，貝爾實驗室的Andrus Jules和Walter L. Bond也開發(fā)了蝕刻（photoengraving）技術(shù)，通過使用氧化物層在硅半導(dǎo)體上生成圖案，1964年獲得專利(美國授予US3122817A)。

圖3. Lathrop和Nall關(guān)于半導(dǎo)體制造的專利，1959年

2.微流控的最佳搭檔

正如Whitesides所述，微流控有四個搭檔：分子生物學(xué)，分子分析，國家安全和微電子學(xué)（molecular biology, molecular analysis, national security and microelectronics）。

最古老的被認(rèn)為是分子分析，其中包括氣相色譜（GPC）或毛細(xì)管電泳（CE）等方法。這些技術(shù)從20世紀(jì)50年代和60年代開發(fā)，通過在狹窄的試管或毛細(xì)管中流動少量樣品，可以分離化合物或生物分子，達到高靈敏度和分辨率（圖4）。

圖4 。（A）Stellan Hjertén教授，他在1967年首次使用毛細(xì)管進行電泳，并使用自動化版毛細(xì)管自由區(qū)電泳儀（圖像源）。（B）控制阿波羅航天器的計算機的邏輯或非IC組件(1960年代)和(C) PCR機的原型“Baby Blue”，PCR機器的原型：軟件控制器與熱循環(huán)塊集成，1986年（圖片來自 Science Museum Group）。

最著名的微流控搭檔是微電子學(xué)：最初研究人員試圖直接將制造方法和材料從微電子技術(shù)應(yīng)用到微流體學(xué)：光刻以及硅和玻璃是微流體階段的第一批參與者。直到后來微流體才通過使用新的特定微加工方法和材料從微電子和半導(dǎo)體技術(shù)中分離出來。

微流體學(xué)的一個鮮為人知但關(guān)鍵的先行者是軍事檢測。從1994年開始，DARPA（美國國防高級研究計劃局）為微機電系統(tǒng)（MEMS）的發(fā)展以及小型化和便攜式“芯片實驗室”的發(fā)展作出了重大貢獻，其主要目標(biāo)是檢測化學(xué)和生物武器。

分子生物學(xué)，特別是20世紀(jì)80年代的基因組學(xué)，作為其第四個“搭檔”，在微流體誕生和進化方面做出了巨大貢獻?？茖W(xué)家對核酸研究和測序的興趣促使開發(fā)了能夠處理小樣本的測序儀，以確保高靈敏度讀數(shù)。一個著名的例子，PCR用于通過加熱擴增DNA序列的（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是在20世紀(jì)80年代早期由Kary Mullis開發(fā)的。反應(yīng)需要少量液體，通常為10-200μl，因此需要精密設(shè)備。最初，由于缺乏自動化設(shè)備，反應(yīng)是一個耗時的多步驟過程，必須手動執(zhí)行。第一臺商用機器，簡單的熱循環(huán)儀，于1987年開發(fā); 它使過程可靠，其小尺寸使得可以小型化操作以及在實驗室外工作。

3. 從MICROFLUIDIC LAB-ON-A-CHIP 到ΜTAS概念

從20世紀(jì)50年代開始，人們越來越關(guān)注設(shè)計小型化系統(tǒng)和組件，由于新技術(shù)以在半導(dǎo)體上創(chuàng)建復(fù)雜的3D微圖案，使設(shè)計小型化系統(tǒng)和組件成為可能。研究從小型化傳感器，傳感器和其他組件，然后將它們與微型計算機集成，以獲得便攜式（小尺寸）集成平臺，用作環(huán)境或醫(yī)療監(jiān)視器/測量系統(tǒng)。

斯坦福大學(xué)的Stephen Terry開展了一項開創(chuàng)性的工作，他在20世紀(jì)70年代中期生產(chǎn)了一種集成在硅片上的小型氣相色譜儀（GC）（圖5）。微型氣相色譜儀由氣體供應(yīng)器，進樣系統(tǒng)，毛細(xì)管柱和輸出微型熱導(dǎo)檢測器組成。注入閥和毛細(xì)管通過微機械加工技術(shù)制造在硅晶片上，而從20世紀(jì)50年代末開始開發(fā)的集成電路（IC）處理方法用于檢測器微制造。該器件被認(rèn)為是“芯片實驗室”的第一個例子。

圖5. SC Terry撰寫并于1979年在IEEE Transactions on Electron Devices上發(fā)表關(guān)于微型氣相色譜儀的文章。

跟隨Terry的腳步，瑞士研究員兼分析化學(xué)家Andreas Manz是最早在化學(xué)領(lǐng)域使用微芯片技術(shù)的公司之一，在90年代將實驗室縮小到芯片尺寸 。1990年，他發(fā)表了一篇論文，其中他介紹了用于化學(xué)傳感的小型化“總化學(xué)分析系統(tǒng)”（縮寫為“μ-TAS”）的概念，即能夠在分析中執(zhí)行所有步驟的微流體裝置（圖6）。他證明，與化學(xué)傳感器和傳統(tǒng)分析系統(tǒng)相比，μTAS可以實現(xiàn)更快，更有效的樣品分離（色譜或電泳），更短的傳輸時間和更少的試劑消耗。此外，多通道器件的制造使得實驗可以并行進行。

圖6.表示理想化學(xué)傳感器的方案，TAS（總化學(xué)分析系統(tǒng)和小型化μ-TAS，如Manz等人所述。

在1993年，他在玻璃芯片上創(chuàng)建了一個μTAS，可以在幾秒鐘內(nèi)完成氨基酸的毛細(xì)管電泳。該裝置通過微機械加工在Pyrex玻璃中制造，并且由長度為1至10cm，橫截面為10×30μm的毛細(xì)管組成。結(jié)果證明了創(chuàng)建可用于復(fù)雜分析的小型芯片實驗室的可能性。

一年后，化學(xué)和生物微系統(tǒng)學(xué)會（CBMS）組織了第一次關(guān)于μTAS的研討會，介紹其基本概念和技術(shù)。

4.微流控芯片制造主要參與者：軟光刻和PDMS

軟光刻

能夠圖案化小結(jié)構(gòu)的技術(shù)的發(fā)展是微電子學(xué)和光電子學(xué)的基礎(chǔ); 從20世紀(jì)60年代開始，制造集成電路和其他微元件的最常用方法是光刻。該名稱表示一系列不同的技術(shù)，其提供通過光源（UV，X射線，......）從光掩模到固體基板上的光致抗蝕劑的圖案轉(zhuǎn)移。然而，當(dāng)使用非半導(dǎo)體材料（例如玻璃和聚合物）時，光刻法被證明是一個困難的過程，并且從20世紀(jì)80年代后期開始開始新的非平版印刷微加工工藝。研究人員正在尋找一種廉價的技術(shù)，能夠?qū)?D結(jié)構(gòu)（也在非平面表面）進行圖案化，以控制表面化學(xué)，這可以用于更廣泛的材料，因此能夠克服光刻的所有缺點。因此，軟光刻誕生了。與光刻法相比的主要區(qū)別在于彈性體模具可用于轉(zhuǎn)移圖案而不是剛性光掩模，并且可以直接圖案化多種材料（有機和生物分子，聚合物等）。

一些最著名的軟光刻技術(shù)，如復(fù)制模塑（REM），微轉(zhuǎn)移模塑（μT），微接觸印刷（μCT）和毛細(xì)管中的微模塑（MIMIC），成為微流體技術(shù)中非常成功的微加工技術(shù)。

圖7.使用硅母版的快速原型制作彈性微流體裝置，然后復(fù)制成型以獲得彈性復(fù)制品。

PDMS

siloxanes組成PDMS的主鏈的高分子，在1927年（英國化學(xué)家 Frederick Stanley Kipping 圖8）。作為硅化學(xué)的創(chuàng)始人之一，他開始研究silicones從1899年開始，并于1904年創(chuàng)造了silicone這個詞。1943年，道康寧公司成立，是康寧玻璃公司與康寧公司的合資企業(yè)。根據(jù)Kipping的方法，陶氏化學(xué)公司成為第一家silicones制造商。

圖8.英國化學(xué)家Frederick Stanley Kipping

眾所周知第一個微流體裝置通常由硅和玻璃制成，因為源自微電子的制造技術(shù)。然而，這些材料存在一些問題：硅是昂貴的并且由于其不透明性而不能與光學(xué)顯微鏡耦合，而硅和玻璃都具有低透氣性，這使得它們不適合應(yīng)用于生物學(xué)的微流體。研究人員正在尋找可替代的化合物，與以前的化合物相比，這種化合物具有光學(xué)透明、易于加工、靈活和廉價的特點。有機聚合物似乎是一個很好的選擇，在20世紀(jì)90年代末，哈佛大學(xué)的George Whitesides團隊引入了一個低成本微流體的新概念，使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)作為微芯片快速成型的新材料(圖9)。

圖9.由哈佛大學(xué)Whitesides團隊于1998年復(fù)制成型制造的第一個PDMS微流體裝置的通道的電子顯微鏡掃描（SEM）

5.微流控與生物學(xué)：人體芯片（HUMAN-ON-A-CHIP）

與微電子學(xué)中使用的傳統(tǒng)材料相比，PDMS的主要優(yōu)點之一是它與細(xì)胞的相容性以及容易培養(yǎng)簡單生物如秀麗隱桿線蟲。在20世紀(jì)90年代后期，微流體裝置被用于細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)用，例如分選或模式化細(xì)胞和蛋白質(zhì)，基于細(xì)胞的生物傳感器，共培養(yǎng)研究。Albert Folch和他的同事能夠在沒有表面修飾的情況下，以膠原蛋白和纖維連接蛋白為模板，選擇性地在PDMS通道上對細(xì)胞和細(xì)胞共培養(yǎng)進行模式設(shè)計(1998-1999)(圖10)。

Figure 10. The cellular micropatterning method described by Folch et al. [16]: the microscopic image shows two distinct lines of fibroblasts (stained respectively in green and red), patterned by directly injecting the cells suspensions into the microchannels.

研究人員很快開始研究微流體裝置，這些裝置可用作藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的組織和器官模型，病理生理學(xué)和生物過程的研究，以克服體外和體內(nèi)限制。在器官上芯片發(fā)展上，自2000年代以來，已經(jīng)提出了許多針對腸，肝，腦，心臟，眼睛，皮膚，肺，肌肉，血管和腫瘤的芯片組織模型。2010年，Huh 等人開發(fā)了一種仿生裝置，用于在其結(jié)構(gòu)，功能和機械方面模擬肺泡 - 毛細(xì)血管界面。與先前工作相比的主要差異是在能夠重建功能性微環(huán)境的不同組織的單個芯片上的集成。它們的裝置由兩個PDMS微通道組成，這兩個PDMS微通道由多孔PDMS膜隔開，一側(cè)接種人肺泡上皮細(xì)胞，另一側(cè)接種人肺內(nèi)皮細(xì)胞，從而形成上皮和內(nèi)皮細(xì)胞。通過注射空氣重建肺泡界面，從而模仿人類呼吸（圖11）。

Figure 11. The breathing lung-on-a-chip device proposed by Hu et al. [18]. (left) Chip and cells culture view. The side chambers are used to apply vacuum and recreate the alveolar-capillary movement by the PDMS mechanical stretching and (right) the chip layers, with a porous PDMS membrane between the two channels.

在過去十年中，器官芯片技術(shù)發(fā)展迅速，部分原因在于使用了替代軟光刻的工藝，特別是快速原型制作，如3D打印，這是一種在20世紀(jì)80年代早期開發(fā)的技術(shù)。該方法目前用于生產(chǎn)組織工程支架，如生物印刷器官，電子器件，傳感器以及微流體系統(tǒng)。利用3D打印，可以快速且低成本的方式獲得能夠模仿復(fù)雜微流體環(huán)境的三維結(jié)構(gòu)嵌入式裝置。Lee 等人2016年開發(fā)了一種一步式3D生物打印方法，用于生產(chǎn)organ-on-a-chip平臺，并通過再現(xiàn)肝臟器官的主要功能來展示該裝置的性能。他們使用poly(e-caprolactone) 作為平臺材料，ECM-based hydrogels to simulate the microenvironment and collagen and gelatin hydrogels encapsulating cells as inks to build 3D platforms.

本世紀(jì)初，許多研究人員認(rèn)識到，試圖模擬器官水平功能的體外平臺不足以研究體內(nèi)發(fā)生的許多生理、器官間的聯(lián)系。然后設(shè)計了第一個“人體芯片（human-on-a-chip）”細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，使身體小型化，研究器官之間的相互作用和代謝(圖12)。

Figure 12. This picture by Williamson et al. [22] clearly represents the concept of human-on-a-chip: some anatomy sketches from Leonardo da Vinci (1490) showing 3D organs and their interactions are used to show the structure and the aim of this device, i.e. mimic the complex human physiology on a single chip.

自21世紀(jì)初以來，對同一平臺上不同組織的整合進行了一些初步研究。2004年，Viravaidya 等人開發(fā)了μCCA（微細(xì)胞培養(yǎng)模擬）來研究新藥的生物累積和ADMET（吸收，分布，代謝，消除和毒性）途徑。微芯片由四個腔室組成：肺和肝臟隔室包含活細(xì)胞和脂肪以及其他組織室以分配流體。同樣，在2009年，Zhang和同事設(shè)計了一種多通道微流體裝置，用于從肝臟，肺臟，腎臟和脂肪組織中培養(yǎng)人體細(xì)胞進行藥物篩選，從而形成分隔的微環(huán)境。在過去十年中取得了許多進展，使得有效的芯片技術(shù)成為可能 。最近，麻省理工學(xué)院的研究人員開發(fā)了一種芯片體由10個隔室組成，同時模擬肝，肺，腸，子宮內(nèi)膜，腦，心臟，胰腺，腎臟，皮膚和骨骼肌。該平臺允許研究新化合物，評估對人體的潛在副作用（芯片上的物理作用）以及腫瘤轉(zhuǎn)移的建模。