免責(zé)聲明：文章來(lái)源《楊朝勇課題組》微信公眾號(hào) 編輯：面面 撰稿人：劉藝龍  以傳播知識(shí)、有益學(xué)習(xí)和研究為宗旨。 轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除。

大家好！今天為大家介紹本課題組2020 年發(fā)表在Small上的文章，題目為 “Highly Sensitive Minimal Residual Disease Detection by Biomimetic Multivalent Aptamer Nanoclimber Functionalized Microfluidic Chip”。本工作受自然界中攀援植物的啟發(fā)，構(gòu)建了一種具有柔性骨架的多價(jià)核酸適體聚合物，結(jié)合“增頻碰撞”的微流控芯片，提出了一種入侵性低、靈敏度高、臨床適用性強(qiáng)的微小殘留病檢測(cè)新方法。論文的第一作者是本課題組三年級(jí)博士生劉藝龍同學(xué)（課題組網(wǎng)頁(yè)：http://www.yang-lab.com/）。

【背景】
        微小殘留病（Minimal residual disease, MRD）是指治療過(guò)程中或完全緩解后存在于白血病患者體內(nèi)的少數(shù)白血病細(xì)胞，是白血病復(fù)發(fā)的主要原因。精準(zhǔn)的MRD檢測(cè)結(jié)果可用于評(píng)估患者對(duì)初始治療的反應(yīng)，進(jìn)而按照危險(xiǎn)度進(jìn)行分層治療，還可用于評(píng)估造血干細(xì)胞移植后的疾病負(fù)荷變化以及預(yù)測(cè)白血病早期復(fù)發(fā)等。然而，傳統(tǒng)的MRD檢測(cè)技術(shù)面臨靈敏度較低或者臨床適用性較差的問(wèn)題。例如，對(duì)于急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）來(lái)說(shuō)，基于流式細(xì)胞術(shù)的免疫表型分析臨床適用性好（適用于超過(guò)90%的患者），但其靈敏度僅為~10^-4（在10⁴個(gè)背景細(xì)胞中檢測(cè)出1個(gè)白血病細(xì)胞），因此需要高入侵性的骨髓穿刺進(jìn)行取樣；相反，基于RT-qPCR的遺傳學(xué)檢測(cè)的靈敏度高至10^-6，但其僅適用于不到20%的表達(dá)常見(jiàn)融合基因的T-ALL患者。因此，發(fā)展一種入侵性低，靈敏度高，臨床適用性強(qiáng)的MRD檢測(cè)新技術(shù)具有重要臨床意義。 

        微流控技術(shù)具有容易集成，高通量和高靈敏度等優(yōu)勢(shì)，特別適用于外周血中微小殘留病細(xì)胞的富集和檢測(cè)。其中，相比于物理分離方法，結(jié)合特異性識(shí)別分子的親和捕獲方法具有靶細(xì)胞捕獲率和純度高的優(yōu)點(diǎn)。核酸適體被譽(yù)為“化學(xué)抗體”，在癌細(xì)胞識(shí)別與捕獲方面具有許多優(yōu)于抗體的特點(diǎn)，例如價(jià)格低廉、批次間差異小、容易修飾和組裝等，最重要的是能夠通過(guò)互補(bǔ)DNA置換或者核酸酶降解等方法實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的無(wú)損釋放，為癌細(xì)胞的下游分析提供前提。但是，核酸適體的空間結(jié)構(gòu)易受復(fù)雜環(huán)境的影響，從而影響其親和力，阻礙其臨床應(yīng)用。因此，設(shè)計(jì)高穩(wěn)定性和高親和力的核酸適體探針是解決上述難點(diǎn)的關(guān)鍵。

【設(shè)計(jì)思路】

自然界中的攀援植物具有靈活的骨架，能夠幫助它們適應(yīng)不同的地勢(shì)，而骨架上眾多的吸盤(pán)或卷須結(jié)構(gòu)，能幫助它們牢牢地攀附在支撐物上面。受此啟發(fā)，作者通過(guò)簡(jiǎn)單的自由基聚合反應(yīng)合成了具有柔性骨架的多價(jià)核酸適體聚合物（MANC），長(zhǎng)而靈活的骨架可適應(yīng)細(xì)胞的表面拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)，且骨架上的眾多核酸適體能與白血病細(xì)胞上的多個(gè)受體結(jié)合，這種協(xié)同的“多價(jià)識(shí)別”效應(yīng)能夠顯著提升核酸適體對(duì)靶細(xì)胞的親和力。同時(shí)，作者利用了課題組前期為了提高循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲效率而設(shè)計(jì)的具有“增頻碰撞”作用的微流控芯片，進(jìn)一步增加白血病細(xì)胞與MANC的碰撞頻率。該芯片內(nèi)按照確定性側(cè)向位移原理排布了上萬(wàn)個(gè)旋轉(zhuǎn)的三角形微柱，血樣流過(guò)芯片時(shí)，尺寸較大的白血病細(xì)胞能夠發(fā)生側(cè)向偏移，反復(fù)與微柱上的MANC碰撞，從而提高捕獲率；而尺寸較小的血細(xì)胞則沿著原本的流線向前運(yùn)動(dòng)，與微柱碰撞表面的MANC碰撞概率低，從而減小背景細(xì)胞的非特異性吸附。最后，作者選用核酸酶處理以選擇性地釋放被捕獲的白血病細(xì)胞，為白血病細(xì)胞下游分析提供了前提（圖1）。

圖1 （A）仿生多價(jià)核酸適體聚合物的合成；（B）協(xié)同尺寸分離和多價(jià)識(shí)別的白血病細(xì)胞親合捕獲及選擇性釋放的微流控平臺(tái)
【數(shù)據(jù)介紹】作者在系統(tǒng)地優(yōu)化完聚合反應(yīng)條件后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)證明了該反應(yīng)具有很高的重現(xiàn)性；通過(guò)假設(shè)1）所有反應(yīng)單體的反應(yīng)活性相等；2）聚合物和DNA marker具有相同的電泳遷移率，得出聚合物上的平均核酸適體數(shù)量為~30條（圖2A）。同時(shí)，考察了40%（v/v）人血清條件下單價(jià)核酸適體和多價(jià)核酸適體聚合物與靶標(biāo)細(xì)胞的平衡解離常數(shù)。如圖2B-C所示，單價(jià)核酸適體的Kd值為59 ± 9 nM，而多價(jià)核酸適體的Kd值下降至1.03± 0.14 nM，仍具有非常高的親和力。

圖2 多價(jià)核酸適體聚合物的表征。（A）聚合產(chǎn)物分子量及聚合反應(yīng)重現(xiàn)性表征；（B-C）單價(jià)核酸適體（C）和多價(jià)核酸適體（D）對(duì)靶細(xì)胞的平衡解離常數(shù)表征

        通過(guò)生物素和鏈霉親和素之間的強(qiáng)相互作用，制備了多價(jià)核酸適體聚合物功能化的微流控芯片（MANC-Chip）。為了證明MANC-Chip提高了細(xì)胞捕獲性能，作者對(duì)比了全血條件下MANC-Chip、單價(jià)核酸適體修飾功能化的芯片（Sgc8-Chip）、嫁接隨機(jī)DNA序列的聚丙烯酰胺功能化的芯片（nMANC-Chip）的白血病細(xì)胞回收率（圖3A）。通過(guò)回歸方程的斜率計(jì)算捕獲效率，MANC-Chip的白血病細(xì)胞捕獲率高達(dá)92.2%，相比Sgc8-Chip提高了2.45倍，而非特異吸附率僅為0.11%（圖3B）。作者接著考察了芯片的細(xì)胞釋放性能。如圖3C-D所示，88.9%的靶標(biāo)細(xì)胞在核酸酶處理后能被選擇性的釋放，而吸附的正常白細(xì)胞幾乎不會(huì)從芯片上脫落，這進(jìn)一步提高了靶細(xì)胞的純度，且核酸酶釋放后，細(xì)胞活性仍有93.8%，為進(jìn)一步的培養(yǎng)和分析提供了前提（圖3E-F）。

圖3 芯片的細(xì)胞捕獲和釋放性能表征。（A）回收率；（B）捕獲率；（C）核酸酶介導(dǎo)的白血病細(xì)胞釋放；（D）MANC-Chip的細(xì)胞釋放率；（E-F）細(xì)胞釋放后的活性表征

最后，作者將MANC-Chip應(yīng)用于捕獲臨床T-ALL患者外周血樣本中的殘留白血病細(xì)胞，如圖4A所示，同時(shí)表達(dá)T細(xì)胞抗原（CD3）和酪氨酸激酶7（PTK7）的細(xì)胞被認(rèn)定為殘留T淋巴白血病細(xì)胞，而CD3陽(yáng)性且PTK7陰性的細(xì)胞為正常T淋巴細(xì)胞。如圖4B所示，治愈的白血病患者（CR）外周血中的殘留白血病細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)到健康對(duì)照組（HD）的濃度水平；而部分緩解的患者外周血中的殘留白血病細(xì)胞數(shù)量顯著高于健康對(duì)照組（p = 0.0097）。說(shuō)明MANC-Chip可用于區(qū)分部分緩解和完全治愈的T-ALL患者。值得一提的是，作者在一例流式檢測(cè)陰性的患者中檢測(cè)到30個(gè)殘留白血病細(xì)胞，隨后臨床表現(xiàn)證實(shí)該患者疾病復(fù)發(fā)，患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病。說(shuō)明MANC-Chip能在疾病復(fù)發(fā)的早期檢測(cè)到異常數(shù)量的白血病細(xì)胞。

圖4 MANC-Chip在臨床樣本中的應(yīng)用。（A）免疫熒光分析；（B）臨床樣本中殘留白血病細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖
【總結(jié)】
        本工作合成了一種仿生的多價(jià)核酸適體聚合物，顯著提高了核酸適體在復(fù)雜體系中的親和力。結(jié)合“增頻碰撞”微流控芯片，進(jìn)一步發(fā)展了一種低入侵性（外周血取樣），高靈敏度（可達(dá)10^-6），高臨床適用性（10/10）的微小殘留病檢測(cè)新方法。由于其高效的細(xì)胞捕獲性能，MANC-Chip為白血病治療效果評(píng)估，復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等提供了一種無(wú)創(chuàng)性的替代檢測(cè)方法。此外，高效溫和的靶標(biāo)細(xì)胞釋放性能為白血病細(xì)胞下游分析提供可能性，從而幫助我們更好地研究白血病的復(fù)發(fā)機(jī)制等。

原文鏈接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/smll.202000949